PBMC中CARD9、MDC、IL-32在溃疡性结肠炎诊断和病情评估中价值

谢玥 张绍衡 熊瑶 于长辉

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是消化内科常见疾病类型，以腹泻、腹痛、黏液脓血便为主要特征，具有反复发作、迁延难愈特点，因此准确地对UC 做出诊断及评估病情意义重大［1］。目前结肠镜检查和造影是诊断UC 有效方法，但为侵入性，部分患者接受度较差，且不能用于肛管直肠狭窄、肠穿孔、急性期感染、肛周脓肿及严重心脑血管病变者等，具有一定局限性。胱天蛋白酶募集域蛋白9（Caspase recruitment domain -containingprotein 9，

CARD9）基因多态性可增加炎症性肠病易感性，敲除CARD9基因后，肠道炎性反应损伤明显改善［2］。髓样树突状细胞（Myeloid dendritic cell，MDC）在免疫反应和免疫耐受中起到重要作用，可影响肠道黏膜免疫功能及肠道通透性，而UC 患者肠壁内存在过度免疫激活及肠黏膜屏障功能的改变，故推测MDC 与UC 有关［3-4］。白介素-32（Interleukin-32，IL-32）主要由淋巴细胞、自然杀伤细胞等产生，是一种炎症细胞因子，与病毒感染、乙肝等多种炎症类疾病的发生有关［5-6］。本研究探讨PBMC 中CARD9、MDC、IL-32 在溃疡性结肠炎诊断和病情评估中价值，旨在为临床诊疗提供参考，报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2021年1月南方医科大学珠江医院消化内科收治的82 例溃疡性结肠炎患者（UC 组）及体检中心40 例健康体检人群（对照组）进行前瞻性研究，其中UC 组女46 例，男36 例，年龄平均（35.49±4.68）岁，体质量指数平均（22.37±1.21）kg/m2；对照组女18 例，男22 例，年龄平均（36.22±4.07）岁，体质量指数平均（22.48±1.05）kg/m2。两组性别、年龄等资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经本院伦理委员会审核通过，患者及家属均知情同意。

纳入标准：①符合UC 诊断标准［7］；②首次确诊，既往无相关治疗史；③年龄＞18 岁；④自愿签署知情同意书。排除标准：①血液系统疾病者；②自身免疫疾病者；③合并恶性肿瘤者；④妊娠期患者。

1.2 方法

1.2.1 UC 病情程度评估［7］

参考改良Mayo 评分评估病情，缓解期：＜3 分，活动期：≥3 分；轻度：3～5 分；中度：6～10 分；重度：11～12 分。

1.2.2 检测方法

采集清晨空腹肘部静脉血5 mL，应用Ficoll 密度梯度离心法分离纯化外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），应用实时荧光定量聚合酶链反应法检测PBMC 中CARD9mRNA、IL-32mRNA，其中CARD9mRNA 上游引物5′-CCGCGTCTTCTCCATGAT-3′，下游引物5′-CCGCAGCTCCTTGATGAA-3′，IL-32mRNA 上游引物5′-CGACTTCAAAGAGGGCTACC-3′，下游引物5′-GAGTGAGCTCTGGGTGCTG-3′，内参β-actin 上游引物5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物5′-CTACGGAGCAATGATCTTGA-3′，收集每个反应管内荧光信号达到设定的阈值四所经历的循环数（Cycle threshold，Ct）值后应用ΔΔCt 法检测基因的相对表达量，ΔCt 实验组基因=实验组基因的Ct 值-实验组的β-actin Ct 值，ΔCt 对照组基因=对照基因的Ct 值-对照组β-actin 的Ct 值，ΔΔCt=ΔCt 实验组基因-ΔCt 对照组基因，检测基因相对表达量=2-ΔΔCt；应用流式细胞仪（深圳迈瑞公司BricyteE6）检测MDC 水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 处理数据，计量资料以（）表示，多组间比较以单因素方差分析，两两比较以LSD-t检验，组间比较采用独立样本t检验，计数资料用n（%）表示，行χ2检验，采用受试者工作特征曲线（ROC）及ROC 下面积（AUC）分析各指标诊断UC 价值，采用Spearman 及多分类Logistic 回归方程分析各指标与UC 活动期患者病情程度关系。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组各检测指标比较

UC 组CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 及CARD9 蛋白、IL-32 蛋白高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组各检测指标比较（±s）Table 1 Comparison of test indicators between 2 groups（±s）

组别UC 组对照组t 值P 值例数82 40 CARD9 mRNA 0.85±0.27 0.46±0.15 8.506＜0.001 MDC（%）0.48±0.16 0.28±0.09 7.349＜0.001 IL-32 mRNA 2.16±0.71 1.06±0.33 9.306＜0.001 CARD9蛋白0.46±0.13 0.35±0.11 4.605＜0.001 IL-32蛋白0.24±0.06 0.17±0.05 6.374＜0.001

2.2 各检测指标诊断UC 的ROC

ROC 曲线显示，单一中MDC 的AUC 0.901（95%CI：0.833～0.947）最大；各指标联合的AUC 0.920（95%CI：0.857～0.962）大于任一单一指标。见表2、图1。

表2 ROC 分析结果Table 2 ROC analysis results

图1 各检测指标诊断UC 的ROCFigure 1 ROC of each test index to diagnose UC

2.3 UC 患者不同病情程度者各检测指标比较

活动期患者CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA、CARD9蛋白、IL-32 蛋白高于缓解期（P＜0.05），随着活动期患者病情程度加重，CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA、CARD9 蛋白、IL-32 蛋白依次增高，两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 UC 患者不同病情程度者各检测指标比较（±s）Table 3 Comparison of various detection indexes of UC patients with different disease severity（±s）

表3 UC 患者不同病情程度者各检测指标比较（±s）Table 3 Comparison of various detection indexes of UC patients with different disease severity（±s）

注：与缓解期比较，aP＜0.05；与轻度比较，bP＜0.05；与中度比较，cP＜0.05。

组别活动期轻度中度重度缓解期F 值P 值例数56 19 21 16 26 CARD9 mRNA 0.97±0.25a 0.70±0.18 0.98±0.24b 1.28±0.27bc 0.59±0.16 28.779＜0.001 MDC（%）0.59±0.12a 0.34±0.11 0.60±0.13b 0.87±0.15bc 0.24±0.10 86.265＜0.001 IL-32 mRNA 2.67±0.54a 1.49±0.44 2.06±0.51b 4.87±0.60bc 1.06±0.32 169.266＜0.001 CARD9蛋白0.52±0.11 0.31±0.12 0.57±0.14 0.70±0.13 0.33±0.10 39.571＜0.001 IL-32蛋白0.29±0.08 0.14±0.04 0.28±0.06 0.48±0.09 0.13±0.04 83.6900＜0.001

2.4 各检测指标与病情程度相关性

以UC 活动期患者各指标为源数据，采用Spearman 进行相关性分析，结果显示，CARD9mRNA（r=0.808，P＜0.001）、MDC（r=0.815，P＜0.001）、IL-32mRNA（r=0.874，P＜0.001）、CARD9 蛋白（r=0.735，P＜0.001）、IL-32 蛋白（r=0.803，P＜0.001）均与病情程度呈正相关。

2.5 多分类Logistic 回归方程分析

以病情程度为因变量（1=轻度，2=中度，3=重度），纳入CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 指标作为自变量（各指标赋值：1=低于UC 组均值，2=高于UC 组均值），应用多分类Logistic 回归方程分析，结果显示，CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA是UC 患者病情程度的相关独立影响因素（P＜0.05）。见表4。

表4 Logistic 回归方程分析Table 4 Multi-class Logistic Regression Equation

3 讨论

CARD9mRNA 在人体脾、肝、外周淋巴细胞等免疫组织中广泛表达，包含行使蛋白募集功能的胱天蛋白募集域和行使蛋白质寡聚化功能的卷曲螺旋域，能通过与B 细胞淋巴瘤因子-10、丝裂原活化蛋白激酶等作用，有效整合多种固有免疫受体识别信号，正常情况下，在小肠和结肠中处于低表达状态［8］。杜晓博等［9］报道，CARD9 蛋白在炎症性肠病患者肠组织中表达高于正常肠组织，与患者病情程度呈正相关，本研究观点与之相似，但本研究检测的是PBMC 中CARD9mRNA 和CARD9 蛋白表达，无需有创性获取肠组织标本，更具临床实际应用价值。UC 是慢性、反复发作性肠道炎症反应，而CARD9mRNA 是肠道固有免疫反应中重要衔接物质，能通过与肽聚糖反应增加肿瘤坏死因子、白介素-6 等炎症介质产生，对肠黏膜造成炎性损伤，破坏肠黏膜屏障作用，影响肠道免疫系统对微生物抗原耐受情况，从而引起错误的免疫反应和炎性反应，参与UC 发生与进展［10］。同时UC 患者粪便和黏膜中总真菌负荷增加，CARD9mRNA和CARD9蛋白升高有利于马拉色菌定植，从而加剧肠道炎症［11］。

骨髓细胞，尤其单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，在先天免疫以及适应性免疫的启动和维持中起着至关重要作用［12］。重度UC 患者治疗前PBMC 中MDC 处于高水平状态，治疗后有效患者则明显降低，若持续升高，提示预后不良，佐证了MDC 在UC 病情和预后评估中的作用［13］。MDC 是髓样树突状细胞，具有抗原提呈作用，可经淋巴管将抗原提呈给未致敏的T 淋巴细胞，使T 淋巴细胞异常激活及肠道黏膜中髓系细胞浸润，介导肠黏膜的免疫炎症损伤，破坏肠黏膜的固有免疫反应，因此与UC 发生和病情进展有关。当PBMC 中MDC＞0.39%时，诊断UC 的AUC 为0.901，敏感度为87.80%，特异度为82.50%，能为临床无创性、简便性诊断UC 提供参考。

IL-32mRNA 参与自然杀伤细胞正常功能、单核细胞分化、角质细胞凋亡、树突细胞成熟的调节［14］。本研究显示，UC 患者IL-32mRNA 高于健康人群，与罗莉芸等［15］报道一致，提示IL-32mRNA 与UC 发病有关。IL-32mRNA 能通过激活核转录因子-kB 和P38 丝裂原活化蛋白激酶途径诱导单核细胞产生白介素-8、肿瘤坏死因子，并能诱导PBMC产生白介素-6、白介素-1β，而生白介素-8、肿瘤坏死因子、白介素-6、白介素-1β 均是UC 中重要的炎性细胞因子，能使炎症区域聚集大量的异常致敏的T 细胞，导致肠黏膜溃疡，加重肠黏膜炎症损伤，所以与UC 发病及病情进展有关。另联合应用的ROC 分析显示，联合检测CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 诊断UC 的AUC高于单一指标，故建议条件允许时，联合检测三者，从而为临床诊断提供更可靠的参考。

综 上，UC 患 者PBMC 中CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA、CARD9 蛋白、IL-32 蛋白显著升高，并与病情程度有关，联合检测CARD9mRNA、MDC、IL-32mRNA 能为临床诊断UC 及评估UC 病情提供参考。