MMP-13、BMP-2及P16在退变腰椎间盘髓核中的表达及临床意义

张培根 张文 解迪 王进

腰椎间盘退变是临床上引发腰椎管狭窄、腰椎间盘突出及慢性下腰痛等疾病的病理基础。近年来，腰椎间盘退变的发病率呈现不断上升趋势［1］。目前本症的发病机制尚未明确，相关研究显示其与细胞及细胞外基质变化有关，因此，探索腰椎间盘退变的细胞学机制，早期采取生物学干预对疾病转归具有重要意义［2］。基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）为重要基质降解酶家族成员之一，相关研究显示，应力负荷对腰椎间盘退变具有诱导作用，且与退变椎间盘中MMP-13 水平变化密切相关［3］。骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic pmtejn-2，BMP-2）是调节椎间盘细胞外基质合成代谢的重要因子，对调节细胞生长、分化、凋亡具有重要作用［4］。P16 为细胞周期G1-S 中的分子信息传导途径，可调控多种肿瘤细胞周期和细胞分化［5］。本研究就MMP-13、BMP-2 及P16 在退变腰椎间盘髓核中的表达及临床意义进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年8月至2020年8月于本院进行手术治疗的90 例腰椎间盘突出症患者的髓核组织为研究组，其中男68 例，女22 例，平均年龄（50.51±7.74）岁，平均病程（8.15±3.51）年，髓核摘除位置为：L4/5、L5/S1。纳入标准：①符合腰椎间盘突出症的疗效评定标准与康复标准［6］；患者均有明显腰痛、坐骨神经痛等症状，下肢受累神经支配区域皮肤感觉减退，直腿抬高试验（+），影像学检查可见椎间盘间突出所致椎管狭窄。②本研究已获得本院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书，且临床资料完整。排除标准：①合并肝、肾、心、肺等重要器官功能不全者；②合并血液系统、免疫功能疾病者。③存在精神疾患无法配合本研究者。根据pfirrmann［6］分级，在T2W1 序列上将椎间盘退变分Ⅰ～Ⅴ级，其中研究组患者处于Ⅲ级：16 例，Ⅳ级：35 例，Ⅴ级：39 例。纳入同期于本院进行前路或后路腰椎骨折手术治疗的50 例患者经病理及MRI 证实为正常椎间盘组织为对照组。男37 例，女13 例，平均年龄（50.57±7.75）岁，取材部位为：T12/L1、L1/2，pfirrmann 分级Ⅰ～Ⅱ为级。两组基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 标本采集和制备

所有患者在手术治疗中，予以髓核标本切除，标本切除后立即用无菌生理盐水清洗，将标本分为两份，其中一份标本密封放置于液氮中冻存。另一份标本5 min 内放入中性福尔马林溶液中固定24 h，之后进行石蜡包埋切片，切片厚度为5 μm。每个标本切10 张切片。

1.3 MMP-13、BMP-2 及P16 表达水平检测

MMP-13、P16 检测试剂盒由美国abcam 公司提供；BMP-2 检测试剂盒由汉博士德生物工程有限公司提供。采用免疫组织化学方法进行：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法［7］，将石蜡标本进行切片、烘烤、脱蜡、浸泡。二氨基联苯胺显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，树胶封片。

判断MMP-13、BMP-2 及P16 是否表达的方法和标准［7］：每张切片在镜下分别以低倍镜及高倍镜进行观察，对每张切片上中下及里外中9 个位置进行观察，用Medja Cvberne’s 图像分析软件计算出每张切片的平均灰度值，最后对2 位专家判断结果进行比对（差异较大时，需重新同时共同读片确定）。

采用Volm 双评分法［8］进行判定，在染色均匀的髓核区，选取5 个高倍镜视野（×400）：按阳性细胞百分率（A 值）评分：＜25%为1 分，25%～50%为2 分，＞50%为3 分；按染色强度（B 值）评分：不着色为0 分，浅棕黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。综合染色阳性细胞数与染色强度判断结果［8］：阴性（-）：0 分，弱阳性（+）：1～2 分，中度阳性（++）：3～4分，强阳性（+++）：5～6 分；两种计分的乘积为每例的加权分数，加权分数为0 为阴性，其余均为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料以（）表示，行t检验；计数资料以n（%）表示，行χ2检验，椎间盘退变等级与MMP-13、BMP-2 及P16 水平的相关性使用Pearson相关系数分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组MMP-13、BMP-2 及P16 水平比较

研究组MMP-13、BMP-2 及P16 阳性表达率高于对照组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 两组MMP-13、BMP-2 及P16 水平比较［n（%）］Table 1 Comparison of MMP-13，BMP-2 and p16 levels between 2 groups［n（%）］

图1 免疫组化染色图（SP，×500）Figure 1 Degenerated lumbar intervertebral disc nucleus pulposus（SP，×500）

2.2 两组MMP-13、BMP-2 及P16 平均灰度值水平比较

研究组患者MMP-13、BMP-2 及P16 平均灰度值水平低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组MMP-13、BMP-2 及P16 平均灰度值水平比较（±s）Table 2 Comparison of average gray level of MMP-13，BMP-2 and p16 between 2 groups（±s）

表2 两组MMP-13、BMP-2 及P16 平均灰度值水平比较（±s）Table 2 Comparison of average gray level of MMP-13，BMP-2 and p16 between 2 groups（±s）

组别研究组对照组t 值P 值n 90 50 MMP-13 71.26±10.41 184.52±26.74 35.685＜0.001 BMP-2 76.21±9.57 191.06±21.33 43.838＜0.001 P16 70.03±10.41 186.74±24.06 39.869＜0.001

2.3 退变腰椎间盘髓核MMP-13、BMP-2 及P16表达与椎间盘退变等级的关系

Pearson相关系数分析显示，退变腰椎间盘髓核MMP-13（r=0.983）、BMP-2（r=0.852）及P16（r=0.974）表达与椎间盘退变等级呈正相关关系，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

腰椎间盘退变主要以椎间盘细胞稀少，基质丰富，蛋白多糖聚合体解聚，硫酸角质素和硫酸软骨素的比例增高，水分丧失和胶原类型改变引起的临床变化［9］。

椎间盘结构对维持椎间盘内环境稳定性具有重要作用。既往学者认为，维持椎间盘完整性主要依靠维持椎间盘基质合成及降解平衡，一旦失衡可对椎间盘功能特性造成损害［10］。BMP 为椎间盘细胞外基质关系密切的细胞因子，相关椎间盘细胞研究发现，对椎间盘细胞分裂培养并用BMP-2进行干预可促进椎间盘细胞Ⅱ型胶原表达及蛋白多糖分泌，考虑BMP-2 对人腰椎间盘退变发挥一定作用［11］。BMP-2 作为生长因子，主要通过内分泌、旁分泌及自分泌机制发挥生物学功能，国内外学者曾提出椎间盘退变的病理基础与细胞外基质减少有关，而BMP-2 表达增强对细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白多糖具有保护性［12］。本研究显示，BMP-2 水平在腰椎间盘髓核中呈高表达状态，且平均灰度值水平低于正常椎间盘组织者。椎间盘退变的病理基础是细胞外基质中的Ⅱ型胶原和蛋白多糖减少，BMP-2 异常表达有力提示BMP-2 参与椎间盘的新陈代谢并可能作为椎间盘重建修复中的合成代谢过程重要组份，对抗椎间盘内的分解代谢过程［13］。

MMP-13 又称胶原酶3，对胶原分子具有较强的特异性，可分裂三维螺旋结构，是现临床对软骨研究中较多的胶原酶。研究发现，退变椎间盘损伤的原因与胶原抗体对软骨细胞、硫酸多糖、胶原等合成具有阻碍作用有关［14］。而MMP-13 作用底物主要表达于滑液及软骨中，可使Ⅱ型胶原变性裂解，故相关学者认为MMP-13 表达增高是椎间盘退变损伤并形成恶性循环的原因之一［15］。

P16 作为CDK4 和CDK6 的抑制剂，可抑制细胞周期蛋白复合物活性，导致细胞老化。本研究结果显示，MMP-13、P16 在退变腰椎间盘患者中处于高水平状态。P16 对软骨细胞的Ⅱ型胶原有重要的降解作用，可参与椎间盘退变过程，加重损伤。Yong 等［16］的实验表明，随年龄增加及椎间盘退变程度加重，椎间盘细胞中SA-β-gal 阳性细胞增加，MTL 羧酸降低细胞分裂能力，引起P16 免疫阳性细胞数增加，且退变椎间盘髓核细胞P16 水平随MMP-13 表达增加而增加，进一步佐证MMP-13、P16 与退变腰椎间盘病情发展关系密切。

此外，pfirrmann 分级是临床上反映退变腰椎间盘病程的重要诊断依据，对病情的不同阶段提供了参考依据，能更确切地反映疾病所处的具体阶段和病变严重程度。本研究结果显示，退变腰椎间盘髓核MMP-13、BMP-2 及P16 表达与椎间盘退变等级呈正相关，考虑与MMP-13、BMP-2 及P16 参与椎间盘退变活化调控发挥了重要作用有关。但关于三者具体作用机制尚未明确，未来将扩大样本量，进一步论证MMP-13、BMP-2 及P16 表达与椎间盘退变等级的关系。

综上所述，MMP-13、BMP-2 及P16 水平在退变腰椎间盘髓核中呈异常表达状态，且与椎间盘退变等级显著相关，其表达情况可作为评估椎间盘退变程度的可靠依据。