miR-34、VEGF-C及sIL-2R检测在乳腺癌淋巴结转移中的预测

何姗姗 骆建美 刘贤 宋旭彤

乳腺癌为女性恶性肿瘤的发病之首，死亡率极高［1］。据相关资料显示，我国乳腺癌的发病率逐年升高，且以每年3%～4%的增长速度不断增加，因乳腺癌早期诊断率较低，大多数患者预后不理想［2］。既往文献报道，乳腺癌的发生、发展过程中由多种蛋白共同参与，对乳腺癌发生的机制、诊断及治疗进行深入研究，对改善患者预后，延长生存期有重要意义［3］。miRNA 可阻遏靶基因的翻译，血清微小RNA34（microRNA34，miR34）是miRNA 中一类高度保守的抑癌基因，能抑制靶基因表达［4］。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）是肿瘤生成过程中特异性最高的促血管生长因子，可促进肿瘤细胞生长、增殖［5］。可溶性白细胞介素-2 受体（Solubleinterleukin-2receptor，sIL-2R）是肿瘤坏死因子细胞网络中的重要组成部分，在抗病毒和抗肿瘤免疫方面发挥着重要的作用［6］。国内外文献关于miRNA、VEGF-C 及sIL-2R与乳腺癌淋巴结转移的关系研究较少。本研究通过检测乳腺癌患者血清miRNA、VEGF-C 及sIL-2R水平，分析联合三者检测对乳腺癌淋巴结转移的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年3月至2019年3月在本院就诊的97 例乳腺癌患者，根据有无淋巴结转移分为：淋巴结转移组40 例、无淋巴结转移组57 例。纳入标准：①所有患者均经病理组织活检并确诊为乳腺癌［7］；②纳入研究前未服用过影响激素水平的药物；③无其他恶性肿瘤病史；④均签署知情同意书。排除标准：①合并严重免疫力缺陷者；②合并严重精神类疾病，无法正常沟通者；③子宫内膜炎、盆腔子宫内膜异位症及其他生殖系统疾病者；④一般资料不齐全者。选取同期在本院进体检的97 例健康者作为对照组。3 组患者一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。本研究经医院医学伦理委员会批准通过。

表1 3 组患者一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general data of 2 groups（±s）

表1 3 组患者一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general data of 2 groups（±s）

组别淋巴结转移组无淋巴结转移组对照组F/χ2值P 值n 40 57 97年龄（岁）53.37±4.35 53.45±4.39 53.22±4.11 0.060 0.946平均体重（kg）54.30±3.89 54.39±3.92 53.12±3.75 1.440 0.240病程（年）4.43±0.55 4.32±0.50 1.810 0.168乳腺癌家族史（有/无）5/35 7/50 8/89 0.893 0.640

1.2 方法

1.2.1 miR-34 检测方法

采用实时荧光定量PCR 检测各组中miR-34相对表达量。RNA 提取试剂Trizol 购自宝生物工程（大连）有限公司。RT-PCR 引物序列如下：miR-34 正 向 引 物 为5′-CAA TCG GGT ACT TGC TGG GCT TTC3′，反向引物为5′-GAG GGC CAT ACC TTA ACG CGT TAA TG3′。PCR 反 应 体 系共20 μL。其中，荧光混合物10 μL，10 μmol/L。正向引物和反向引物各1 μL，50×ROX 染料II 0.5 μL、cDNA 模板1 μL，双蒸水6.5 μL。反应条件：95℃2 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃15 s，共40 个循环。miR-34 以U6 为内参基因。采用2-ΔΔCt计算相对表达量。

1.2.2 VEGF-C、sIL-2R 检测方法

对照组于体检当日，乳腺癌患者于入院后次日清晨8：00 空腹抽取肘静脉血4 mL，其中2 mL 用含0.109 mol/L 枸橼酸1∶9 抗凝，3 500 r/min 离心10 min 分离血浆。采用酶联免疫吸附实验检测VEGF-C、sIL-2R，试剂盒由美国贝克曼库尔特提供，检测仪器为DXI800 美国贝克曼库尔特全自动免疫分析仪。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料采用（）表示，组间比较采用t检验、多组间比较采用F检验；计数资料通过n（%）表示，采用χ2检 验；绘制ROC 曲 线，并 计 算ROC 曲线下面积（AUC），以分析miR-34、VEGF-C 及sIL-2R 检测及三者联合检测对对乳腺癌患者淋巴结转移的预测价值；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组之间miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比较

3 组之间miR-34 水平比较：对照组＞无淋巴结转移组＞淋巴结转移组，差异有统计学意义（P＜0.05）；3 组之间VEGF-C、sIL-2R 水平比较：淋巴结转移组＞无淋巴结转移组＞对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组之间miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比较（±s）Table 2 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels among groups（±s）

表2 各组之间miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比较（±s）Table 2 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels among groups（±s）

组别淋巴结转移组无淋巴结转移组对照组F 值P 值n 40 57 97 miR-34 1.92±0.17 2.64±0.29 3.59±0.35 475.370＜0.001 VEGF-C（ng/L）534.45±49 .87 421.12±45.47 226.65±37.52 857.390＜0.001 sIL-2R（U/mL）765.32±59.65 512.14±47.14 325.48±40.69 1270.350＜0.001

2.2 不同病理特征组中miR-34、VEGF-C、sIL-2R水平比较

病理学分级为低、中分化的患者miR-34 低于高分化者，VEGF-C、sIL-2R 高于高分化者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者miR-34 高于Ⅲ～Ⅵ期者，VEGF-C、sIL-2R 低于Ⅲ～Ⅵ患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。有淋巴血管间隙浸润的患者miR-34 低于无淋巴血管间隙浸润者，VEGF-C、sIL-2R 高于无淋巴血管间隙浸润者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 不同病理特征组中miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比较（±s）Table 3 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels in different pathological characteristics groups（±s）

表3 不同病理特征组中miR-34、VEGF-C、sIL-2R 水平比较（±s）Table 3 Comparison of miR-34，VEGF-C and sIL-2R levels in different pathological characteristics groups（±s）

临床特征年龄肿瘤最大直径（cm）肿瘤数目病理学分级TNM 分期淋巴血管间隙浸润＜50≧50＜5≧5单发多发低、中分化高分化Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅵ期有无n 51 46 42 55 39 58 47 50 58 39 43 54 miR-34 3.10±0.35 2.99±0.33 3.11±0.31 3.05±0.27 3.12±0.37 2.98±0.34 2.89±0.31 3.55±0.38 3.48±0.37 2.94±0.33 2.68±0.35 3.39±0.41 t 值1.588 1.017 1.919 9.381 7.587 9.032 P 值0.116 0.312 0.058＜0.001＜0.001＜0.001 VEGF-C 407.25±30.14 410.12±30.25 388.35±39.65 395.32±40.12 396.32±41.13 401.21±41.33 551.32±50.36 412.12±41.55 421.36±40.46 537.65±48.63 539.27±42.15 433.12±35.65 t 值0.467 0.852 0.572 14.845 12.357 13.434 P 值0.641 0.396 0.568＜0.001＜0.001＜0.001 sIL-2R 554.65±69.46 551.32±69.10 534.69±70.33 530.14±51.36 514.65±53.45 517.37±63.89 752.12±71.23 503.36±59.12 516.78±62.35 733.64±68.98 741.23±71.14 523.45±61.25 t 值0.236 0.368 0.219 18.700 15.770 16.192 P 值0.814 0.714 0.827＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 联合miR-34、VEGF-C、sIL-2R 检测对乳腺癌淋巴结转移的预测价值

miR-34、VEGF-C、sIL-2R 三者联合检测灵敏度、特异度分别为93.65%、94.23%，显著高于单一检测（P＜0.05）。见表4、图1。

表4 联合miR-34、VEGF-C、sIL-2R 检测对乳腺癌淋巴结转移的预测价值Table 4 predictive value of combined detection of miR-34，VEGF-C and sIL-2R in lymph node metastasis of breast cancer

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC Curve

3 讨论

乳腺癌发生淋巴结转移这一过程是由多基因及多种生化标志物共同参与的，由于肿瘤抑制基因、生化指标功能丧失，进而表现出细胞不受调控的增殖、分化和凋亡抑制等［8］。因此，临床上致力于寻找更多高特异度的乳腺癌相关基因，以期通过多个指标联合检测为乳腺癌的诊断、病情评估、靶向治疗及预后风险评估提供依据。

本研究中，三组之间miR-34 水平比较：对照组＞无淋巴结转移组＞淋巴结转移组；三组之间VEGFC、sIL-2R 水平比较：淋巴结转移组＞无淋巴结转移组＞对照组，与国外研究报道结果一致［9］。因此可以推测miR-34、VEGF-C 及sIL-2R 表达对乳腺癌淋巴结转移等生物学行为有显著的影响作用。miRNA 是一类高度保守的非编码内源性RNA 分子，可通过结合于其下游靶基因3′端非编码区，从而调控靶基因的转录，进而影响细胞的生物学行为［10］。VEGF-C 是肿瘤细胞生长过程中重要的血管内皮因子，特异性高，而乳腺癌淋巴结转移依赖于血管生成［11］。sIL-2R 是机体重要的免疫调节物质，对于巨噬细胞的吞噬作用有明显的刺激作用，一定程度上促进患者癌细胞转移［12］。低表达的miR-34 会影响肿瘤细胞的增殖，并促进细胞凋亡，而高水平的VEGF-C 及sIL-2R 对乳腺癌淋巴结转移有一定促进作用，对促进乳腺癌病情进展有显著影响。

本研究还发现，病理学分级（低、中分化）、TNM（Ⅲ～Ⅵ期）、有淋巴血管间隙浸润的患者miR-34 表达量较低，VEGF-C、sIL-2R 水平较高，认为低表达量的miR-34、高水平的VEGF-C、sIL-2R 会推动病情进展，促进癌细胞淋巴结转移，与Shah 等学者［13］研究结论一致。miR-34 是miRNA家族中有抑癌作用的一类基因，在结直肠癌、食管鳞状细胞癌、乳腺癌、膀胱癌等恶性肿瘤中均呈异常低表达状态，研究认为miR-34 异常低表达可作为恶性肿瘤诊断、病情评估、预后的标志［14］。VEGF-C 是一种由多种细胞分泌的糖蛋白，有较高的血管渗透性，为肿瘤细胞生长、增殖提供了有利条件［15］。sIL-2R 由多淋巴细胞合成，对肿瘤的发生、发展，与机体炎症因关系密切。既往研究发现，sIL-2R 可作为免疫抑制剂，改善机体内分泌，通过抑制已活化的T 细胞克隆抑制机体免疫力，促进恶性肿瘤分化、增殖［16］。相关研究指出，结直肠癌患者中sIL-2R 表达水平较高，认为sIL-2R 对癌细胞的发生、发展、转移均有一定预测作用［17］。

绘制ROC 曲线结果表明联合miR-34、VEGFC、sIL-2R 检测可用于预测乳腺癌患者淋巴结转移情况。

综上所述，miR-34、VEGF-C、sIL-2R 与乳腺癌淋巴结转移情况有关，联合三者检测对评估乳腺癌病情、预测淋巴结转移情况作用重大。