木脂素-1通过抑制DNA拓扑异构酶I诱导胃癌细胞凋亡的机制研究

娄红刚 张琛涵 康富贵 聂静云 柴琛

据统计，我国新发胃癌病例占全球范围内所有胃癌的44.10%左右［1］。DNA 拓扑异构酶I（Topoisomerase I，TopoI）在胃癌肿瘤细胞DNA 复制、转录中具有关键作用，抑制其活性是选择性抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的重要靶点［2］。目前，羟基喜树碱（Hydroxycamptothecin，HCPT）是唯一上市的以TopoI 为靶点的抗肿瘤药物，在多种肿瘤治疗中取得一定疗效，但临床实践发现此类化合物存在药物代谢效力低下、稳定性差异等局限性［3］。故亟需开发以TopoI 为靶点的非喜树碱类药物。木脂素属于天然化合物，结构类型丰富，具有包含抗炎、抗病毒、抗肿瘤在内的广泛生物活性［4］。本研究通过体外实验探讨Mzs-1 诱导SGC-7901 细胞凋亡、靶向抑制TopoI 的机制，为临床开发、应用Mzs-1 作为治疗胃癌候选药物提供实验依据。报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

Mzs-1 有青岛科技大学夏亚穆教授合成提供，人胃癌细胞株SGC-7901 购于上海生命科学研究院，由兰州大学第一临床医学院中心实验室冻存，DEME 培养基（高糖）购于Gibco 公司，PBS 购于Hyclone 公司，胎牛血清（FBS）购于浙江天杭生物科技股份有限公司，0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）购于北京索莱宝科技有限公司，双抗（青/链霉素100×）、50×TAE 缓冲液、Meilunred 核酸电泳染料、羟基喜树碱（HCPT）购于大连美仑生物技术有限公司，DMSO 购于Sigma 公司，CCK-8 购于上海翊圣生物科技有限公司，PBR322 质粒、DNA Topo I、DNA marker、6× Loading buffer 购于TaKaRa 公司，琼脂糖购于HydraGene 公司，Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、PMSF 蛋白酶抑制剂购于上海碧云天生物技术有限公司，SDSPAGE 凝胶制备试剂盒、5×电泳缓冲液、10×转膜缓冲液、10× TBST、RIPA 裂解液、5×蛋白上样缓冲液购于北京索莱宝科技有限公司，甲醇购于天津市光复科技发展有限公司，脱脂奶粉购于Biofroxx 公司，蛋白标记物（marker）购于Thermo Scientific 公司，兔抗人Topo I 单克隆抗体购于Proteintech 公司，兔抗人β-actin 单克隆抗体购于爱必信生物科技有限公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 购于北京中杉金桥生物技术有限公司，ECL 化学发光液、聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）购于Biosharp 公司。

1.2 方法

Mzs-1 使用二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，经滤膜孔径0.45 μm，滤器抽滤除菌后，置于4℃冰箱中保存，各组DMSO 浓度均低于0.1%。将人胃癌细胞株SGC-7901 分装于含有2 mL 原始培养基的25 cm2细胞培养瓶中，再加入完全培养基2 mL，放置在37℃、二氧化碳饱和湿度35%的细胞培养箱中进行培养，当细胞长满培养瓶底面积80%～90%后，依次进行细胞传代、细胞冻存、细胞复苏及细胞计数处理。采用CCK-8 法检测Mzs-1 对人胃癌细胞株SGC-7901 增殖抑制的影响，以酶标仪检测450 nm 处吸光度（OD）值，OD值重复测量3 次，取平均值。细胞存活率（%）=（加药组OD 值-空白组OD 值）/（阴性对照组OD 值-空白组OD 值）×100%，采用GraphPad Prism5 计算药物半数抑制浓度（IC50）。采用流式细胞术检测Mzs-1 对SGC-7901 细胞凋亡及细胞周期的影响，采用琼脂糖凝胶电泳Mzs-1 对TopoI 活性的影响，采用蛋白印迹法检测TopoI 蛋白表达量。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 22.0 进行统计学分析，计量资料以（）描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两组间比较采用LSD-t 检验，两组间比较采用独立样本t检验；实验数据使用GraphPad Prism5 软件进行作图及计算药物IC50，以P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Mzs-1 对SGC-7901 细胞的增殖抑制作用

Mzs-1 能明显抑制SGC-7901 细胞增殖，且存在时间-浓度依赖性（P＜0.05）。见图1。

图1 Mzs-1 对SGC-7901 细胞的增殖抑制作用Figure 1 The inhibitory effect of Mzs-1 on the proliferation of SGC-7901 cells

2.2 Mzs-1 对SGC-7901 细胞的诱导凋亡作用

不同浓度Mzs-1 处理SGC-7901 细胞48 h 后，各组早期凋亡细胞比率差异有统计学意义（P＜0.05）；与空白对照组相比，不同浓度Mzs-1 处理SGC-7901 细胞48 h 后，随着Mzs-1 浓度增加，早期凋亡细胞比率不断升高，且呈现浓度依赖性（P＜0.05）。与HCPT 阳性对照组比较，Mzs-1 浓度为80 μg/mL 时早期凋亡率略高（P＞0.05）。见表1。

表1 Mzs-1 对SGC-7901 细胞早期凋亡率的影响（±s）Table 1 The effect of Mzs-1 on the early apoptosis rate of SGC-7901 cells（±s）

表1 Mzs-1 对SGC-7901 细胞早期凋亡率的影响（±s）Table 1 The effect of Mzs-1 on the early apoptosis rate of SGC-7901 cells（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05。

药物空白对照组Mzs-1 HCPT 阳性对照组F 值P 值n 3 3 3药物浓度（μg/mL）0 10 20 40 80 10 1198.004＜0.001早期凋亡率（%）1.10±0.18 2.23±0.08a 10.60±0.20a 11.90±0.20a 18.37±0.57a 18.19±0.63

2.3 Mzs-1 对SGC-7901 细胞周期的影响

不同浓度Mzs-1 作用于SGC-7901 细胞48 h后，各组处于G2/M 期细胞比例差异有统计学意义（P＜0.05）；与空白对照组相比，相同时间内，随着Mzs-1 药物浓度增加，处于G2/M 期细胞比例明显增加（P＜0.05）；与HCPT 阳性对照组相比，Mzs-1浓度为80 μg/mL 时G2/M 期细胞比例略高（P＞0.05）。见图2、表2。

图2 Mzs-1 对SGC-7901 细胞周期变化的影响Figure 2 The effect of Mzs-1 on SGC-7901 cell cycle changes

表2 Mzs-1 对SGC-7901G2/M 期细胞比例的影响（±s）Table 2 The effect of mzs-1 on the proportion of SGC-7901 cells in G2/M phase（±s）

表2 Mzs-1 对SGC-7901G2/M 期细胞比例的影响（±s）Table 2 The effect of mzs-1 on the proportion of SGC-7901 cells in G2/M phase（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05。

药物空白对照组Mzs-1 HCPT 阳性对照组F 值P 值n 3 3 3药物浓度（μg/mL）0 10 20 40 80 10 1508.620＜0.001 G2/M 期（%）8.30±2.19 11.58±0.93a 13.67±1.07a 15.56±0.83a 46.74±0.40a 46.60±0.65

2.4 Mzs-1 对DNA TopoI 活性的影响

与只加入pBR322 DNA 泳道相比，加入TopoI的超螺旋pBR322 DNA 被解旋为松弛型DNA；HCPT 阳性对照组在浓度为10 μg/mL 时完全抑制TopoI 对pBR322 DNA 的解旋作用；加入Mzs-1 的泳道随着药物浓度增加，超螺旋DNA（SC）增多，Mzs-1 浓度为40 μg/mL 时，完全抑制TopoI 活性，与HCPT 对照组趋势一致。见图3。

图3 Mzs-1 对DNA TopoI 活性的影响Figure 3 The effect of Mzs-1 on DNA TopoI activity

2.5 Mzs-1对SGC-7901细胞TopoI蛋白表达的影响

Mzs-1 处 理SGC-7901 细胞48 h 后，各组TopoI 蛋白相对表达量差异有统计学意义（P＜0.05）；与空白对照组相比，随Mzs-1 药物浓度增加，TopoI 蛋白表达量逐渐下降（P＜0.05），且Mzs-1浓度为80 μg/mL 时抑制率略低于HCPT 阳性对照组。见表3。

表3 Mzs-1 对SGC-7901 细胞中TopoI 蛋白相对表达量的影响（±s，n=3）Table 3 The effect of Mzs-1 on the relative expression of TopoI protein in SGC-7901 cells（±s，n=3）

表3 Mzs-1 对SGC-7901 细胞中TopoI 蛋白相对表达量的影响（±s，n=3）Table 3 The effect of Mzs-1 on the relative expression of TopoI protein in SGC-7901 cells（±s，n=3）

注：与对照组相比，aP＜0.05。

药物空白对照组Mzs-1 HCPT 阳性对照组F 值P 值药物浓度(μg/mL)0 10 20 40 80 10 51.762＜0.001灰度值比(TopoI/β-actin)1.10±0.07 0.88±0.12a 0.71±0.10a 0.48±0.04a 0.37±0.05a 0..24±0.06

3 讨论

胃癌是国内最常见消化道恶性肿瘤之一，发病率、死亡率仅次于肺癌，总体预后仍处于较低水平［5］。胃癌早期无明显症状，多数患者就诊时已处于进展期甚至晚期，丧失手术根治时机，放化疗成为主要治疗手段，可杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞扩散，延长生存时间，但毒副反应较多，严重降低患者生存质量［6］。

中医药疗法在减轻临床症状、抑制转移、减少复发等抗肿瘤治疗中卓有成就。牛蒡属于菊科牛蒡属植物，其果实可入药，称为牛蒡子，木脂素类化合物是其主要活性成分，具有调节免疫、保肝、抗病毒、抗炎等作用［7］。同时，大量国内外报道证实，木脂素具有良好抗肿瘤作用，此类化合物可经由众多途径抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡［8-9］。而细胞增殖与凋亡失衡是胃癌的基本病理机制［10］。Mzs-1 是以牛蒡子活性成分衍生物为基础合成的一种新型木脂素类化合物，属于木脂素类的合成前体。本研究结果提示Mzs-1 可能通过阻滞SGC-7901 细胞，使其停滞于G2/M 期，从而诱导细胞凋亡，最终抑制人胃癌细胞株SGC-7901 增殖。因此，探究Mzs-1 在胃癌中的抗肿瘤作用机制、开发高效的药用Mzs-1 具有重要意义。

Topo 可直接影响或参与细胞DNA 复制、转录等过程，其中TopoI 对单链DNA 作用，每次仅作用于一条链，能够催化DNA 链断裂和重新连接，无需能量辅助因子，可直接发挥相关作用［11］。TopoI 具有增殖依赖性，在非循环增殖细胞与循环增殖细胞中无差异，研究显示，TopoI 虽无肿瘤特殊性，但与正常组织相比，在肿瘤细胞中的表达量显著升高［12］。故抑制TopoI 活性成为临床公认抗肿瘤药物的作用靶点。目前，HCPT 是临床应用较为广泛的化疗药物，其主要作用机制便是经由抑制TopoI 活性诱导肿瘤细胞凋亡，已投入到胃癌的治疗中。但临床证实，HCPT 因其自身耐药性、稳定性、患者个体差异性等因素导致疗效受限［13］。本研究采用琼脂糖凝胶电泳法测定Mzs-1 对TopoI 活性的影响，发现随着Mzs-1 浓度增加，TopoI 活性逐渐下降直至失活。由此可知，Mzs-1 能够抑制TopoI 活性，其作用机制可能在于以下两个方面：一方面Mzs-1 可能通过直接抑制TopoI 催化活性导致其失活，另一方面Mzs-1 可能是经由干扰TopoI 与DNA 结合，促使TopoI、DNA、药物形成三元复合物，从而阻滞DNA 复制，诱导肿瘤细胞死亡。

为进一步探究Mzs-1 抗肿瘤活性及相关机制，本研究结果发现TopoI 蛋白表达量随Mzs-1 浓度增加呈不断降低趋势。说明Mzs-1 能靶向抑制TopoI 蛋白表达。此外，体内、体外实验均表明，TopoI 抑制剂的抗肿瘤作用主要与诱导肿瘤细胞凋亡有关，多数涉及线粒体依赖途径，即经由Caspase 家族介导的凋亡途径发挥相关药物作用，作用机制与激活、上调Caspase-3 相关［14-15］。有文献指出，采用Mzs-1 处理SGC-7901 细胞株后，Caspase-3 表达呈上调趋势［16］。提示Mzs-1 靶向抑制TopoI 表达的作用可能是依赖于Caspase-3 的酶联反应而启动细胞凋亡程序。且与HCPT 相比，Mzs-1 具有可人工合成、成本较低等优势，为临床治疗胃癌提供新思路。

综上可知，Mzs-1 能抑制人胃癌细胞株SGC-7901 增殖，诱导SGC-7901 细胞凋亡，机制可能与Mzs-1 抑制SGC-7901 细胞内TopoI 活性及蛋白表达有关。但Mzs-1 对其他恶性肿瘤细胞的抑制增殖、诱导凋亡作用仍需进一步探索。