甘薯与海边近缘野生种（厚藤）杂交亲和性测试和分析

2021-09-02张雄坚黄立飞房伯平陈景益王章英罗忠霞杨义伶

热带农业科学 2021年7期

张雄坚黄立飞房伯平陈景益王章英罗忠霞杨义伶

(广东省农业科学院作物研究所/广东省作物遗传改良重点实验室广东广州 510640)

野生种质资源在甘薯育种中，具有重要作用，主要是利用其抗病虫及抗逆特性，并能达到一定的效果［1-2］。在抗逆性方面，利用海边滩涂近缘野生种厚藤的特异性，培育耐盐甘薯品种，是非常有益的探讨研究。海边近缘野生种厚藤，中文学名马鞍藤，拉丁文名Ipomoea pes-caprae（L.）R.Br.subsp.Brasiliensis，别名厚藤、鲎藤、二叶红薯、狮藤、马蹄金、马蹄草、海茹藤，染色体2n＝2x＝30［3］，生长在海滩，属于沿海地区广泛分布的固沙绿化植物。研究表明，盐胁迫下，随着盐浓度的升高，可溶性糖、游离脯氨酸、厚藤可溶性蛋白以及Na+/K+升高，膜透性增加，说明厚藤是一种耐高盐植物［4］；盐胁迫下，马鞍藤MDA、Pro、可溶性糖、总蛋白含量与净光合速率等5项指标均呈现出规律性变化，可作为马鞍藤盐胁迫的响应指标，能够迅速和有效地通过自身调节来抵御盐胁迫带来的影响，具有较强的耐盐能力，为耐盐甘薯种质资源创新和耐盐基因挖掘提供了理论依据［5］。厚藤作为甘薯的近缘海边野生种，除具有极强的耐盐耐旱性外，也是海洋植物药材，是中国南方沿海地区民间常用海洋中药和京族习用植物药材，同时也是澳大利亚、墨西哥、泰国、巴西、巴基斯坦等多个热带及亚热带国家的传统药用植物，其化学成分主要包括树脂糖苷类、萜类、黄酮类、酚酸类、挥发性成分、甾体类等。现代药理研究表明，厚藤具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、镇痛、抗胶原酶、抗氧化、免疫调节等多种药理活性［6］。为探究甘薯近缘海边野生种厚藤的抗逆、药效基因，以便利用其潜在的基因资源，已在基因和分子水平方面开展了相关研究。先是测定基因组大小及收集特征信息，为马鞍藤进一步的全基因组深度测序和甘薯耐盐基因挖掘奠定基础［7］。通过对厚藤ASR（ABA-stressripening）基因IpASR的克隆和序列分析，明确该基因的生物学功能是作为厚藤体内的重要胁迫应答基因，在适应滨海高盐干旱环境的过程中发挥重要作用，为作物的抗逆分子育种提供理论依据［8］。已成功克隆厚藤的Actin基因IpActin1，为后续克隆厚藤的抗逆功能基因和分析基因表达模式提供了内参基因，同时也为进一步研究厚藤的抗逆分子机制奠定基础［9］。利用厚藤与甘薯进行常规杂交，通过分子标记辅助育种，可达到提高甘薯抗逆性和增强其保健功效的目的，这也是可行的研究和必要的探讨。但无论是有性杂交还是体细胞杂交，能够与甘薯杂交并成功获得种间杂种的野生资源有限，目前仅报道4个种：I.trifida（2X，4X，6X）、I.1triloba、I.1lacunosa、I.cairica［2］，尚未见有关近缘野生种厚藤与甘薯杂交的研究报道。因此，本研究拟测定近缘野生种厚藤与甘薯有性杂交的亲和性，为进一步尝试厚藤与甘薯的有性杂交、结实和种子收获提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

耐盐的海边近缘野生种厚藤（Ipomoea pescaprae），采自广东省阳江市沿海地区，甘薯［Ipomoea batatas（L.）Lam，2n＝6X＝90］品种共有14个，包括广薯87、广薯79、广紫薯2号、广紫薯10号、三色甘薯、黔菜2号、广薯12-87、越南紫薯、绵紫薯9号、心香、广薯菜9号、广薯69、广薯205、普薯32，均来自广东省农科院作物所甘薯研究室，作为甘薯杂交亲本。

1.2 方法

为了使杂交期间能够开花，甘薯亲本和厚藤都用嫁接诱导。以另一个近缘野生种树牵牛（Ipomoea carneasubsp.fistulosa）作砧木，分别以甘薯亲本和厚藤苗6～8 cm长的顶芽为接穗；用15 mg/L奈乙酸（NAA）蘸浸接穗楔尖，然后用保鲜尼龙膜包扎嫁接；嫁接后用大棚遮光网遮阴。待亲本正常生长后，于2017年至2020年开花期间（从10月份至次年6月份），根据开花情况，将甘薯品种与厚藤配对组合，进行授粉杂交；采用雌蕊染色速测法［10］观察花粉萌发情况。上午将甘薯品种与近缘野生种进行授粉杂交，4 h后，取雌蕊染色压片，在倒署置显微镜（型号Olympus CX X41）下观察花粉萌发，计算亲和指数，评价亲和强弱，确定亲和性。染料制备：将苯酚、甘油、乳酸、蒸馏水按体积比例为1∶1∶1∶1.5混合，加曙红染色剂，经加热溶解过滤制成；于2020年3月27日上午，观察3个组合授粉杂交后的结实挂果情况。

杂交授粉时，若花粉粒不萌发，看不到花粉管，表示完全不亲和；若萌发的花粉管清晰、数量多、发育正常且稳定，则表示完全亲和。但多数处于这两者的中间状态，即花粉管有的模糊不清，有的少，有的多，有的不正常，表明亲和性有所差异，据此估算亲和指数，评价亲和性程度。甘薯品种与近缘野生种厚藤杂交的亲和指数按以下公式计算。

式中：N，花数；N0，无花粉粒萌发的花数；N1，萌发花粉管模糊的花数；N2，萌发花粉管数少（1-3条）的花数；N3，萌发花粉管数中但花粉管不正常的花数；N4，萌发花粉管数中（4～7条）的花数；N5，萌发花粉管数多但花粉管不正常的花数；N6，萌发花粉管数多（8～10条）的花数；N7，萌发花粉管数极多（＞11条）的花数；N8，萌发花粉管伸入花柱的花数

根据亲和指数确定各甘薯品种与近缘野生种厚藤杂交的亲和性强弱：极弱，亲和指数≤20.0）；弱，20.0＜亲和指数≤40.0）；中，40.0＜亲和指数≤60.0）；强，60.0＜亲和指数≤90.0）；极强，亲和指数＞90.0。

2 结果与分析

2.1 品种差异

将14个甘薯品种与近缘野生种进行授粉杂交，结果显示，有6个亲本品种可观察到花粉萌发，具有一定的亲和性，占总数42.9%；另有8个亲本品种未观察到花粉萌发，即表现为不亲和性，占总数57.1%。因此，甘薯品种与海边近缘野生种厚藤（Ipomoea pescaprae）杂交，有些品种具有亲和的表现，但多数品种表现不亲和。甘薯与近缘野生种（厚藤）杂交的正交6个组合全部表现为亲和；反交中，有3个组合不亲和，3个组合有少量的萌发，表现出极弱的亲和性，即甘薯与近缘野生种杂交，正交亲和的多，反交亲和的少，表明近缘野生种作父本，容易亲和；而甘薯作父本，亲和性比较低。近缘野生种无明显的甘薯杂交群别属性，同一甘薯群别中，既有亲和，也有不亲和，因此，不属于甘薯当中的杂交群别［11］（表1），亲和性只跟甘薯品种有关。

表1 甘薯和海边近缘野生种杂交亲和情况

2.2 花粉粒萌发类型

不同的品种组合，萌发的花粉管有差异，表明与近缘野生种厚藤杂交亲和的甘薯品种，亲和性有一定的差异。花粉萌发的差异，可分为5种类型。无花粉萌发：由图1可知，普薯32与海边近缘野生种杂交，只见花粉粒（箭头所指），无萌发的花粉管，说明杂交不亲和。花粉管模糊：花粉粒萌发的花粉管似是而非（图2），模棱两可（箭头所指）。花粉管细长：广薯87与海边近缘野生种杂交，花粉粒萌发的花粉管细长（图3），无膨大的花粉管头，不正常（箭头所指）。花粉管正常：海边近缘野生种与广薯79杂交，花粉粒萌发的花粉管略粗，花粉管头膨大（图4），花粉管多且正常（箭头所示），亲和性好。花粉管进入花柱：海边近缘野生种与广薯79杂交（图5），花粉管进入花柱（箭头所示）。

图1 普薯32×海边近缘野生种

图2 花粉管模棱两可

图4 海边近缘野生种×广薯79（一）

图5 海边近缘野生种×广薯79（二）

2.3 亲和指数及差异

根据萌发的花粉管不同，计算亲和指数，亲和强弱。结果表明，广薯79×海边近级野生种组合亲和指数最高，为50.7，能达中等亲和；5个组合弱，3个组合极弱，没有强或极强组合（表2）；说明目前的测试中，与海边近缘野生种（厚藤）杂交，并未发现亲和性较好的甘薯品种。

表2 亲和杂交组合亲和指数计算和亲和性评价

2.4 不同时期亲和性差异

亲和组合中，不同时期亲和性强弱亦有差异。从图6可知，亲和指数出现明显峰值。亲和性较典型的品种广薯87、广薯79及广紫薯2号亲和指数出现双高峰值趋势，分别出现在11月上旬、11月中旬和次年4月的下旬，但不同的亲和组合或有一定的差异，有的偏强，有的偏弱；在最适合的亲和期杂交，容易结实，可收到杂交种子。因此，在亲和指数较低的情况下，需选择亲和指数高峰期进行杂交，才更有望达到结实效果。

图6 杂交亲和指数曲线图

2.5 杂交挂果

在与海边近缘野生种（厚藤）的杂交组合中，作母本的广薯87、广紫薯2号，和广薯79的亲和指数相对较高，分别为39.0、44.8和50.7；杂交授粉（2020年3月27日）后，第一次（4月7日，即10日后）调查显示，掉果率分别是77.8%、41.7%和10.0%。由此可见，亲和指数越低，越容易掉果，且掉果率高；亲和指数相对高的品种，掉果率也低，挂果率高，差异趋势明显；说明测定亲和指数，对实际杂交有一定的指导作用，可避免无效杂交。第二次（4月10日，即13日后）调查显示，弱亲和性组合已全部掉果，而中度亲和性组合还有40.0%的挂果率，表明亲和性弱易掉果，亲和性强则可延长挂果期（表3）。

表3 亲和指数高组合挂果测试

3 讨论与结论

3.1 讨论

研究表明，广州甘薯开花制种季节（10—12月），甘薯与海边近缘野生种杂交，多数品种无花粉萌发，表现为不亲和，可能是由于胼胝质［12］随着温度下降而增多所至；随着次年春季高温来临，渐见花粉萌发，此时较适宜授粉杂交，可见结实，但此时正值高温高湿期，亲本苗老化，不利于进一步结实观察试验。据报道，不同甘薯栽培种与四倍体近缘野生种海滨野牵牛（I.littoralis）杂交后的结实率有明显差异。杂交结实率比较高的组合，其亲本栽培历史长，遗传基础稳定；而结实率较低或根本不结实的组合，多半为播种1—2年的杂种后代品系，遗传基础特别是减数分裂行为不稳定，有可能影响其与四倍体野生种杂交的结实率［13］，这与本研究的杂交亲和结果相似。同时，从形态特征看，试验用的海边近缘野生种（厚藤）与甘薯亲缘关系较远，授粉杂交测试过程有很多品种无花粉萌发；而萌发的组合，正反交差异也很大，且花粉萌发效果不稳定。测定亲和性，从中筛选高亲和指数的强亲和组合，在适宜的亲和期进行杂交授粉，杂交组合可结实，同时可收获种子。在强亲和组合中，可进一步将甘薯与野生种杂交的胚珠进行离体培养，提高种间杂交成苗的成功率，解决甘薯与近缘野生种杂交后胚发育中止的问题［14］，有望培育出甘薯与海边近缘野生种厚藤的杂交苗，充分利用海边近缘野生种厚藤的耐盐基因、药效及其抗逆性强的优势。