经典瞬时受体电位通道1在胃癌组织中的表达及其生物学意义
2021-09-02胡宁朱晓锋
胡宁，朱晓锋
作者单位：咸宁市中心医院湖北科技学院附属第一医院，a胃肠外科一病区，b心胸外科，湖北咸宁437100
胃癌是我国最常见的消化道肿瘤，占2015年我国癌症发病顺位的第2位（40.3万例），且占我国因癌死亡的第3位（29.1万例）。尽管手术切除、放化疗和靶向药物等措施在胃癌的诊治中取得了较大进展，但终末期胃癌的5年生存率仍不足30%。
经典瞬时受体电位通道（transient receptor potential canonical，TRPC）为一类分布广泛的钙离子通道，通过调控钙离子内流，参与一系列的生物学过程。研究表明，经典瞬时受体电位通道1（TRPC1）通道在多种恶性肿瘤中表达上调，包括乳腺癌、甲状腺癌和肝细胞癌等。然而，尚不清楚TRPC1通道在胃癌中的表达及其生物学效应。因此，本研究首先检测TRPC1在胃癌组织中的表达情况，分析其与胃癌病人临床病理特征的关系，以期为胃癌的精准治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 临床标本收集
收集咸宁市中心医院2015年1月至2018年4月93例手术切除的胃癌和癌旁组织标本，所有病人术前均未接收放、化疗或其他抗肿瘤治疗。其中男性62例，女性31例，年龄范围为35～79岁。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，所有病人均签署了知情同意书。1.2 试剂
TRPC1抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。人胃癌MGC-803细胞购自中科院上海细胞库。TRPC1小分子干扰RNA（siRNA-TRPC1）质粒购自 上 海Genechem公 司。Trizol、PrimeScriptRTPCR试剂盒、噻唑蓝试剂盒和凋亡流式试剂盒均购自瑞士Roche公司。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司。丙二醛、活性氧和超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。1.3 实验方法
1.3.1
免疫组织化学染色包埋后将组织标本切成4～5 μm厚的薄片，经脱蜡、抗原修复等处理后，滴加3%的小牛血清封闭。分别加入适量的TRPC1抗体和二抗，复染细胞核后脱水封片，显微镜下观察。结果判定：（1）以阳性细胞数＜5%计为0分，5%～25%计为1分，＞25%～50%计为2分，＞50%～75%计为3分，＞75%～100%计为4分。（2）以无着色计为0分，黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。将两者得分相乘后：以＜3分为阴性表达，≥3分为阳性表达。1.3.2
细胞培养和转染将复苏后的人胃癌MGC-803细胞培养在RPMI1640培养基，选择处于对数期的细胞，接种于6孔板中。按照说明书的步骤操作，利用siRNA沉默TRPC1的表达。根据实验设计，将其分为三组：对照组、空载体组和转染组。其中对照组不做任何处理，空载体组仅转染无任何靶基因的siRNA，转染组则转染siRNA-TRPC1。1.3.3
MTT法检测细胞增殖情况将转染后的人胃癌MGC-803细胞接种于96孔板中，密度为5×10/孔，设置3个复孔。分别于转染后0、12、24、48、72 h，加入7 g/L的噻唑蓝溶液，孵育5 h后加入二甲基亚砜溶液。37℃孵育10 min后，酶标仪检测各组细胞在490 nm波长处的吸光度值，以对照组为参照，计算细胞存增殖活性。上述实验均重复3次。1.3.4
逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞mRNA水平收集细胞，加入Trizol试剂提取总RNA，并将其反转录成互补DNA（cDNA）。按照PrimeScriptRT-PCR试剂盒说明书的操作步骤，在RT-PCR仪进行PCR扩增。以GAPDH作为内参，进行定量分析。GAPDH正向引物序列为5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，反向引物序列为5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'。TRPC1正 向 引 物 序 列为5'-ACTTCAACAGCGA-3'，反向引物序列为5'-ATACCAGGAAATGAGC-3'。上述实验均重复3次。1.3.5
蛋白质印迹法（Western blotting）检测细胞蛋白水平收集细胞并提取细胞蛋白，检测TRPC1的蛋白表达。具体操作步骤如下：每孔加入200 μL裂解液，提取细胞总蛋白并进行定量分析。制备凝胶并按每孔40 μg蛋白量上样电泳，将蛋白转移到PVDF膜上。脱脂奶粉封闭1 h后，加入适量的一抗，4℃孵育，等渗缓冲盐溶液（TBST）洗膜后加入二抗，37℃孵育1h。使用Odyssey成像系统扫膜，以GAPDH为参照物，检测TRPC1的表达水平。上述实验均重复3次。1.3.6
检测细胞氧化应激水平收集细胞，检测各组样品的蛋白浓度，按照各试剂盒说明书的步骤操作，检测SOD、丙二醛和活性氧的水平。上述实验均重复3次。1.3.7
检测细胞凋亡水平收集细胞，加入200 μL的结合缓冲液使细胞重悬。分别加入5 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）染色液，上机检测细胞凋亡水平。上述实验均重复3次。
2 结果
2.1 TRPC1在胃癌及癌旁组织中的表达
免疫组化结果显示TRPC1蛋白表达于细胞内，呈棕黄色颗粒。TRPC1在胃癌组织的阳性表达率显著高于癌旁组织（79.6%比20.4%，χ
=65.054，P
＜0.001）。2.2 TRPC1的表达与胃癌病人临床病理特征的关系
TRPC1的高表达与肿瘤的TNM分期、分化程度和淋巴结转移相关（均P
＜0.05），而与性别、年龄、肿瘤大小、远处转移、吸烟史和饮酒史无关（均P
＞0.05），见表1。
表1 经典瞬时受体电位通道1（TRPC1）的表达与胃癌临床病理特征的关系/例（%）
2.3 siRNA靶向沉默TRPC1的效果
RT-PCR和蛋白质印迹法结果显示，转染组胃癌MGC-803细胞中TRPC1 mRNA和蛋白表达明显低于对照组（P
＜0.05
）。而对照组与空载体组比较，差异无统计学意义（P
＞0.05）。见表2和图1。
图1 蛋白质印迹法检测转染后各组人胃癌MGC-803细胞TRPC1蛋白水平
表2 转染后的人胃癌MGC-803细胞经典瞬时受体电位通道1（TRPC1）mRNA和蛋白相对表达量/±s
2.4 细胞氧化应激水平检测
与对照组相比，siRNA-TRPC1转染组丙二醛和活性氧水平明显升高，抗氧化酶SOD活性降低（P
＜0.05）。而与对照组比较，空载体组细胞丙二醛、活性氧和SOD水平的差异无统计学意义（P
＞0.05）。见表3。
表3 siRNA沉默TRPC1对人胃癌MGC-803细胞氧化应激水平的影响/±s
2.5 细胞增殖活性
MTT法检测结果显示，72 h时，siRNA-TRPC1转染组细胞增殖活性明显低于对照组（P
＜0.05），而对照组和空载体组间的差异无统计学意义（P
＞0.05）。见表4。
表4 各组人胃癌MGC-803细胞转染后各时点的增殖活性比较/±s
2.6 细胞凋亡水平检测
三组凋亡率比较，F
=356.705，P
＜0.001。与对照组凋亡率（2.23±0.35）%相比，siRNA-TRPC1转染组（10.13±0.87）%显著升高（P
＜0.05），而空载体组（2.37±0.39）%则差异无统计学意义（P
＞0.05）。3 讨论
目前，胃癌已经成为严重威胁我国居民健康的重大疾病之一。因此，深入探究胃癌的发病机制，寻找新的治疗靶点，对于胃癌的防治具有重要意义。本研究结果显示胃癌组织中TRPC1的表达较癌旁组织明显升高，且TRPC1的高表达与TNM分期、分化程度和淋巴结转移呈显著正相关，提示TRPC1可能在胃癌的致病过程中具有重要的作用。
1995年，Wes等首次通过原位杂交技术克隆出人TRPC1蛋白，并定位于3号染色长臂的22-24区。人和小鼠的TRPC1通道蛋白均包含753个氨基酸序列，分子量为91 kDa。研究表明，TRPC1不仅表达在正常器官和组织，在多种肿瘤组织中也均有表达。李英等证实，TRPC1在乳腺癌组织中呈高表达，且和乳腺癌的病理类型、分级有关。研究证实，敲除人滤泡性甲状腺癌细胞中的TRPC1的表达，可显著降低癌细胞的增殖和迁移、促进肿瘤细胞的凋亡。同时有研究也表明，TRPC1在肝细胞癌中的表达显著上调，且siRNA沉默人肝癌Huh7细胞中的TRPC1表达，可明显抑制Huh7细胞的增殖活性。本研究提示转染组细胞TRPC1的mRNA和蛋白质表达水平明显低于对照组，沉默TRPC1的表达可显著降低MGC-803细胞的增殖活性。
氧化应激损伤是指各种病理生理刺激导致活性氧在体内大量蓄积，继而出现细胞或组织损伤。研究表明，活性氧在肿瘤进展过程中发挥着“双刃剑”作用，即低浓度的活性氧通过诱导DNA突变、激活原癌基因和上调肿瘤细胞的代谢水平等促进肿瘤细胞异常增殖。而高浓度的活性氧则抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡。徐湖波等研究表明，上调胃癌细胞的活性氧水平可以抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡。Badr等证实对乙酰氨基酚通过抑制TRPC1的激活，上调活性氧水平，促进人肝癌HepG2的凋亡。与之类似，本研究表明，siRNA沉默TRPC1的表达可显著升高胃癌MGC-803细胞活性氧水平，抑制胃癌细胞的增殖，促进凋亡。
综上所述，TRPC1在胃癌组织中高表达，且与胃癌的TNM分期、分化程度和淋巴结转移密切相关。siRNA沉默TRPC1的表达可以上调MGC-803细胞的氧化应激水平，抑制肿瘤细胞的增殖。然而，本研究仍有不足之处：一是随访时间较短，没有探讨TRPC1的表达与胃癌病人的预后和生存率的关系；二是没有进行动物实验，也没有在多种胃癌细胞中进行验证。因此，这些不足之处是我们接下来的研究方向。
