白花丹素通过调控miR-218-5p/CNTN1表达对子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制

李爱玲 李虹 陈莉萍 (华中科技大学附属武汉市第四医院，湖北 武汉 430034)

子宫内膜癌属于女性生殖系统常见恶性肿瘤，子宫内膜上皮内瘤变等多种因素均可导致子宫颈内膜癌发生，由于女性内分泌系统的复杂性导致子宫内膜癌发病机制尚未完全阐明〔1〕。目前临床常采用手术与激素治疗等方法治疗子宫内膜癌，由于子宫内膜癌细胞迁移及侵袭能力较强导致患者治疗效果差〔2〕。因此探寻子宫内膜癌发生及发展机制，并基于机制研究寻找可有效治疗子宫内膜癌的新型药物对提高治疗效果及改善患者预后均有重要意义。研究表明白花丹素可抑制宫颈癌细胞生长并诱导细胞凋亡，并可抑制肝癌细胞的迁移、侵袭〔3，4〕。相关研究发现白花丹素能通过抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡进而抑制膀胱癌发生及发展，同时可明显抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力〔5〕。 但白花丹素对子宫内膜癌细胞增殖、迁移等恶性生物学行为的影响尚未不清楚。微小RNA(miR)-218-5p在膀胱癌等恶性肿瘤中呈低表达，并可通过调控靶基因表达进而发挥抑癌基因作用〔6〕。通过靶基因网站预测接触蛋白(CNTN)1可能是miR-218-5p的靶基因，研究表明CNTN1在乳腺癌细胞中表达水平升高并能够增强乳腺癌细胞的增殖、克隆形成及侵袭能力〔7〕。 但白花丹素及miR-218-5p、CNTN1对子宫内膜癌细胞增殖、迁移侵袭的影响，且白花丹素是否通过调控miR-218-5p/CNTN1表达影响子宫内膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭目前还尚未可知。因此，本研究观察白花丹素对人子宫内膜腺瘤细胞(HEC)-1A细胞增殖、迁移及侵袭的影响，并初步分析其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1实验细胞与主要试剂 HEC-1A购自上海生命科学院细胞中心。胎牛血清、DMEM培养基、Lipofectamine2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司；噻唑蓝(MTT)试剂、荧光素酶检测试剂均购自美国Promega公司；miR-218-5p mimic、 CNTN1 siRNA、miR-218-5p抑制物(anti-miR-218-5p)及其各自阴性对照序列均购自美国Ambion公司；实时荧光定量-聚合酶链式反应(PCR)试剂盒购自美国ABI公司；兔抗人CyclinD1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、 p21抗体均购自美国Cell Signaling Technolgy公司；Trizol试剂、反转录试剂盒均购自美国ThermoFisher公司；Transwell小室与Matrigel基质胶均购自美国BD公司；凝胶试剂盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、电化学发光(ECL)发光试剂盒与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1百花丹素处理、转染及分组 HEC-1A细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，放入恒温培养箱培养，培养条件为温度为37℃、CO2体积分数为5%、相对湿度为95%，收集对数生长期HEC-1A细胞接种于6孔板，采用瞬时转染技术分别将miR-NC、miR-218-5p mimic、anti-miR-NC、anti-miR-218-5p、si-NC、si-CNTN1转染入HEC-1A细胞，设置为miR-NC组、miR-218-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-218-5p组、si-NC组、si-CNTN1组，严格参照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行操作，转染后6 h更换为新鲜DMEM完全培养基，继续培养48 h后收集细胞进行后续检测。白花丹素处理及分组：分别用浓度为1.0、2.5、5.0 μmol/L的白花丹素处理HEC-1A细胞，将HEC-1A细胞分为对照组(不进行任何处理)、白花丹素1.0 μmol/L组、白花丹素2.5 μmol/L组、白花丹素5.0 μmol/L组，同时筛选出白花丹素适宜处理浓度。为明确白花丹素是否通过调控miR-218-5p表达而发挥作用，在转染anti-miR-218-5p、anti-miR-NC 12 h后使用白花丹素处理24 h，分别设置为白花丹素+anti-miR-218-5p组、白花丹素+anti-miR-NC组，收集HEC-1A细胞进行下一步检测。

1.2.2细胞增殖实验 HEC-1A细胞接种于96孔板，密度为8×103个细胞/孔，放入恒温培养箱继续培养48 h，每组均设置3个复孔，同时设置阴性对照，分别加入质量浓度为5 g/L的MTT试剂10 μl，继续培养2h后弃上清液，分别加入100 μl 二甲基亚砜(DMSO)，振荡溶解30 min，应用酶标仪检测490 nm波长处各孔吸光度值(OD)，计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/阴性对照OD值)×100%。

1.2.3qRT-PCR检测miR-218-5p、CNTN1 mRNA表达水平 用Trizol试剂盒提取HEC-1A细胞总RNA，应用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，取10 ng RNA依据反转录试剂盒合成cDNA，miR-218-5p以U6为内参基因，CNTN1以GAPDH为内参基因。qRT-PCR反应体系包括SYBR Green real-time PCR Master Mix(10 μl/孔)、正反向引物各(1 μl/孔)、cDNA(2 μl/孔)，ddH2O补足体系至20 μl。通过95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，反复循环40次进行PCR扩增反应，每个样品均设置3个复孔，采用2-ΔΔCt法计算miR-218-5p、CNTN1 mRNA相对表达量。

1.2.4Western印迹检测CNTN1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、 p21蛋白表达水平 收集各组对数生长期HEC-1A细胞，加入200 μl蛋白裂解液(RIPA、1%PMSF)，冰上裂解30 min，置于离心机离心15 min，离心机转速为12 000 r/min，离心后收集上清液，用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，取适量蛋白进行10%SDS-PAGE，反应结束后转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭2 h，4℃温度下分别加入适量各蛋白一抗(1∶500)孵育过夜，次日用TBST洗涤3次，15 min/次，室温下分别加入稀释比为1∶2 000的二抗，孵育2 h后用TBST洗涤3次，15 min/次，ECL发光液进行显影反应，曝光后用Scion Image图像分析系统分析各条带光密度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带光密度值/GAPDH条带光密度值。

1.2.5双荧光素酶报告基因检测 收集未经转染的HEC-1A细胞，用胰蛋白酶消化细胞并计数，将细胞以5×104/ml浓度接种于24孔板，待细胞生长汇合率达到60%时进行转染，参照Lipofectamine2000转染试剂说明书将HEC-1A细胞分为：miR-218-5p mimic+WT-CNTN1、miR-218-5p mimic+MUT-CNTN1、miR-NC+WT-CNTN1、miR-NC+MUT-CNTN1，每组均设置3个平行反应复孔，转染后参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组CNTN1相对荧光素酶活性。

1.2.6Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 细胞迁移实验：用不含胎牛血清的DMEM培养液加入Transwell小室上室备用，同时选取各组对数生长期HEC-1A细胞，胰蛋白酶消化细胞，用含胎牛血清DMEM培养基重悬细胞(1×105/ml)，取200 μl细胞悬液加入Transwell小室上室，Transwell小室下室加入500 μl含胎牛血清的DMEM培养基，放入恒温培养箱继续培养48 h后取出Transwell小室，用PBS洗涤，棉签擦拭微孔膜内层细胞，酒精固定5 min，结晶紫染色15 min，显微镜下随机选取5～10个视野并计算转移至微孔膜下层细胞数量。细胞侵袭实验：配制基质胶与无血清DMEM培养基稀释比为1∶8的稀释液，以此稀释比稀释Matrigel基质胶，取100 μl稀释液包被Transwell小室底部的上室面，风干后除去多余液体，并加入不含胎牛血清的DMEM培养液(50 μl/孔)，同时用胰蛋白酶消化各组HEC-1A细胞，弃培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，用含不含胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞(1×105/ml)，在Transwell小室上室加入200 μl细胞悬液，在Transwell小室下室加入含胎牛血清的DMEM培养基，放入恒温培养箱继续培养48 h，取出Transwell小室，PBS洗涤，棉签擦拭Transwell小室微孔膜内面细胞，酒精固定5 min，结晶紫染色15 min，显微镜下随机选取5～10个视野观察并计算移至Transwell小室微孔膜下层细胞。细胞迁移及侵袭实验均设置3次重复，细胞迁移及侵袭能力均与细胞数呈正比。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0进行t检验及单因素方差分析。

2 结 果

2.1白花丹素对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭的影响(48 h) 与对照组比较，白花丹素不同浓度组HEC-1A细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.05)，白花丹素5.0 μmol/L组>白花丹素2.5 μmol/L>白花丹素1.0 μmol/L组(P<0.05);Transwell实验结果显示，与对照组比较，白花丹素不同浓度组HEC-1A细胞迁移及侵袭细胞数均明显减少(P<0.05)，白花丹素1.0 μmol/L组<白花丹素2.5 μmol/L组<白花丹素5.0 μmol/L组(P<0.05);Western印迹实验结果显示，与对照组比较，白花丹素不同浓度组HEC-1A细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均明显降低(P<0.05)，且白花丹素1.0 μmol/L组>白花丹素2.5 μmol/L组>白花丹素5.0 μmol/L组,而p21蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，且白花丹素5.0 μmol/L组>白花丹素2.5 μmol/L组>白花丹素1.0 μmol/L组(P<0.05)，见表1、图1、图2。

图1 子宫内膜癌HEC-1A细胞的迁移侵袭(结晶紫染色，×100)

表明白花丹素可通过降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达及提高p21蛋白表达水平进而抑制子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移及侵袭，且呈剂量依赖效应。

2.2白花丹素对子宫内膜癌HEC-1A细胞中miR-218-5p、CNTN1表达的影响 白花丹素干预后子宫内膜癌HEC-1A细胞中miR-218-5p的表达水平明显高于对照组(P<0.05)，且白花丹素5.0 μmol/L组>白花丹素2.5 μmol/L组>白花丹素1.0 μmol/L组(P<0.05)。白花丹素干预后子宫内膜癌HEC-1A细胞中CNTN1 mRNA及蛋白表达水平均明显低于对照组(P<0.05)，白花丹素5.0 μmol/L组<2.5 μmol/L组<白花丹素1.0 μmol/L组，见图3、表2。结果表明白花丹素可能通过上调miR-218-5p表达并下调CNTN1表达进而参与子宫内膜癌发生及发展过程。由于白花丹素浓度为5.0 μmol/L时对子宫内膜癌HEC-1A细胞的作用效果相对较强，因此后续研究选取白花丹素浓度5.0 μmol/L进行后续实验研究。

图2 Western印迹检测增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

图3 CNTN1蛋白表达

表2 白花丹素对子宫内膜癌HEC-1A细胞中miR-218a-5p、CNTN1表达的影响

2.3miR-218-5p靶向调控CNTN1的表达 miRNA靶基因预测软件发现miR-218-5p可作用于CNTN1的3′UTR，见图4A，通过双荧光素酶报告基因实验显示共转染重组质粒WT-CNTN1、MUT-CNTN1与miR-218-5p mimic后，与MUT-CNTN1相比，WT-CNTN1与miR-218-5p mimic共转染后CNTN1的荧光素酶活性明显降低(P<0.05)，见表3。miR-218-5p组CNTN1蛋白表达水平(0.21±0.03)明显低于miR-NC组(0.61±0.07，P<0.05);anti-miR-218-5p组CNTN1蛋白表达水平(0.93±0.08)明显高于anti-miR-NC组(0.62±0.06，P<0.05)，见图4B。表明miR-218-5p可影响CNTN1活性，CNTN1是miR-218-5p的靶基因，miR-218-5p可负向调节CNTN1表达。

A：CNTN1的3′UTR中含有与miR-218-5p互补的核苷酸序列；B：CNTN1蛋白表达图4 miR-218-5p靶向调控CNTN1的表达

表3 双荧光素酶报告实验

2.4miR-218-5p过表达对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭的影响 miR-218-5p组HEC-1A细胞miR-218-5p表达水平明显高于miR-NC组(P<0.05)，表明miR-218-5p mimic能显著促进HEC-1A细胞miR-218-5p表达。MTT检测显示，上调miR-218-5p表达能够显著增加细胞增殖抑制率(P<0.05)。Transwell实验结果显示miR-218-5p mimic能够显著减少HEC-1A细胞迁移及侵袭数(P<0.05)，表现为进入Transwell小室下室的细胞数量明显减少。Western印迹检测结果显示miR-218-5p组HEC-1A细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均显著下调(P<0.05)，而p21蛋白表达显著上调(P<0.05)，见表4、图5。表明上调miR-218-5p表达可通过下调CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达及上调p21蛋白表达进而抑制子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭。

组别miR-218-5p抑制率(%)迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)CyclinD1蛋白p21蛋白MMP-2蛋白MMP-9蛋白miR-NC组0.99±0.085.17±0.49115.69±10.2392.47±9.230.81±0.080.25±0.030.79±0.070.80±0.08miR-218-5p组3.14±0.2133.27±3.1254.38±6.0246.31±4.250.42±0.040.68±0.060.33±0.040.36±0.04t值23.43521.79412.65211.12710.68115.70113.97612.050P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

图5 Western印迹检测增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达

2.5抑制CNTN1表达对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭的影响 Western印迹显示si-CNTN1组HEC-1A细胞CNTN1蛋白表达显著低于si-NC组(P<0.05)，表明CNTN1 siRNA能够减少HEC-1A细胞中CNTN1表达。与si-NC组比较，MTT实验结果显示si-CNTN1组HEC-1A细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)，表明沉默CNTN1表达可抑制HEC-1A细胞增殖能力；Transwell实验结果显示si-CNTN1组HEC-1A细胞迁移及侵袭细胞数均明显减少(P<0.05)，表明沉默CNTN1表达可抑制HEC-1A细胞迁移及侵袭能力；Western印迹显示si-CNTN1组HEC-1A细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均显著降低(P<0.05)，而p21蛋白表达显著升高(P<0.05)，见图6、表5。表明沉默CNTN1后可通过上调p21蛋白表达及下调CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达进而减弱子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭能力。

图6 Western印迹检测CNTN1和增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达

组别CNTN1蛋白抑制率(%)迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)CyclinD1蛋白p21蛋白MMP-2蛋白MMP-9蛋白si-NC组0.63±0.066.09±0.61113.47±10.3497.53±9.460.82±0.080.22±0.030.78±0.070.76±0.07si-CNTN1组0.19±0.0329.47±2.6856.83±5.5249.38±4.250.45±0.040.67±0.060.31±0.040.34±0.04t值16.06720.83611.83711.37210.13316.43210.09712.761P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0010.000

2.6抑制miR-218-5p表达逆转了白花丹素对HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭的作用 qRT-PCR检测结果显示白花丹素预处理后HEC-1A细胞miR-218-5p表达水平显著高于对照组(P<0.05)，当转染入anti-miR-218-5p时HEC-1A细胞miR-218-5p表达水平显著降低(P<0.05)；Western印迹结果显示白花丹素预处理后HEC-1A细胞CNTN1蛋白表达显著降低(P<0.05)，而转染入anti-miR-218-5p后CNTN1蛋白表达显著升高(P<0.05)。表明白花丹素可上调miR-218-5p表达进而促使靶基因CNTN1蛋白表达下调。MTT检测显示HEC-1A细胞增殖抑制率显著降低(P<0.05)，Transwell实验检测结果显示迁移与侵袭细胞数均显著增加(P<0.05)，Western印迹显示HEC-1A细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均显著上调(P<0.05)，而 p21蛋白表达显著下调(P<0.05)。表明抑制miR-218-5p表达可逆转白花丹素对HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。见图7，表6。

1～4：对照组、白花丹素组、白花丹素+anti-miR-NC、白花丹素+anti-miR-218-5p图7 CNTN1和增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达

3 讨 论

子宫内膜癌恶性程度高、迁移及侵袭能力强等特点导致患者死亡率逐年上升，目前临床采用的治疗手段已不能有效延长患者生存时间〔9〕。随着生物信息学不断发展，靶向治疗成为提高子宫内膜癌患者生存率的重要手段，子宫内膜癌发生及发展过程涉及多种癌基因激活或抑癌基因失活等，因而寻找合适分子靶向治疗的靶点及有效治疗药物对杀伤子宫内膜癌细胞及控制疾病进展等均具有研究价值。研究表明miRNA通过调控靶基因表达而抑制上皮-间质转化功能进而抑制子宫内膜癌细胞迁移及侵袭〔10〕。

白花丹素可通过抑制p38MAPK信号通路及上皮-间质转化过程进而抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖及迁移能力〔11〕。白花丹素是中药白花丹根部提取物，可有效抑制非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞迁移及侵袭能力，并可发挥抗肿瘤作用〔12〕。田林强等〔13〕研究表明白花丹素可能通过下调MMP-2/MMMP-9蛋白表达进而抑制骨肉瘤细胞侵袭。Huang等〔14〕研究表明白花丹素可通过诱导ROS引发内质网应激介导的前列腺癌细胞凋亡。以上研究结果说明白花丹素具有显著抑制BEAS-2B细胞增殖、迁移及侵袭的作用。研究表明通过抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达可抑制子宫内膜癌细胞迁移及侵袭，上调p21蛋白表达可抑制CyclinD1蛋白表达进而抑制子宫内膜癌细胞增殖〔15，16〕。结果证实白花丹素可明显减弱BEAS-2B细胞增殖、迁移及侵袭能力。提示白花丹素可通过上调p21蛋白表达及降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达进而减弱子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。然而，关于白花丹素对子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用还需进行深入研究。

miR-218-5p在前列腺癌患者血清中呈高表达并可作为评估疾病进展的有效标志物〔17〕。Xu等〔18〕研究表明miR-218-5p可通过调控LYN/NF-κB信号通路劲儿抑制宫颈癌细胞的生长和转移。Zhu等〔19〕研究表明miR-218-5p可通过抑制EGFR表达进而抑制非小细胞肺癌细胞增殖及迁移。然而，miR-218-5p在子宫内膜癌中的表达变化尚未可知。通过靶基因网站预测到CNTN1可能是miR-218-5p的靶基因，研究表明CNTN1可促进前列腺癌细胞增殖及迁移进而促进癌症进展过程〔20〕。赵冀等〔21〕研究表明肝细胞癌患者癌组织中CNTN1呈高表达并可能参与肝细胞癌细胞迁移及侵袭过程，同时可作为临床评估患者预后的重要分子标志物。陈楠等〔22〕研究表明上调CNTN1表达可促进乳腺癌细胞增殖。本研究结果提示miR-218-5p可通过调控靶基因CNTN1表达而抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭，其可能作用机制与下调CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达及上调p21蛋白表达有关。

白花丹素对子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用是否通过miR-218-5p/CNTN1轴而实现的，本研究结果提示白花丹素可通过上调miR-218-5p表达并下调CNTN1表达进而减弱HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭能力。

综上，白花丹素可通过上调miR-218-5p表达可通过靶向CNTN1而抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭，白花丹素可能作为一种新型药物治疗子宫内膜癌，可为子宫内膜癌抗肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭的临床治疗提供理论支撑。但还需进一步采用体内研究来明确白花丹素的抗肿瘤活性是否与抑癌基因miR-218-5p激活、促癌基因CNTN1失活有关，关于其通过何种信号通路传递信号均需深入研究。