长链非编码RNA LINC00467靶向miR-1247-5p调控肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

李豪 姬发祥 徐晓宁 马金华 沈存芳 李进章 王丽娟

(青海大学附属医院肿瘤内科，青海 西宁 810000)

肝癌发病率及死亡率较高，临床治疗过程中主要采用手术治疗，但术后患者复发转移率逐年升高〔1〕。因而探讨肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用机制是提高肝癌治疗效果的关键。长链非编码RNA(lncRNA)可参与癌症、心血管疾病等生理病理过程并可发挥重要调控作用〔2〕。lncRNA LINC00467在神经母细胞瘤及结肠癌中高表达，并可促进结肠癌的迁移和侵袭〔3，4〕。LINC00467还可促进肺腺癌细胞增殖和血管生成，且与肿瘤大小和血管侵犯等因素密切相关〔5〕。通过生物信息学软件预测LINC00467可吸附微小RNA-1247-5p(microRNA-1247-5p，miR-1247-5p)进而抑制其表达，研究显示miR-1247在胰腺癌组织中下调表达，miR-1247过表达可抑制胰腺癌细胞的增殖〔6〕。miR-1247在胃癌组织及细胞中均呈低表达，上调miR-1247表达可抑制胃癌细胞增殖及迁移〔7〕。近来研究显示miR-1247-5p可在肝癌发生及发展过程中发挥抑癌基因作用，并可能通过调控Wnt3表达进而抑制肝癌细胞增殖及迁移〔8〕。但LINC00467在肝癌中的表达研究及其是否通过调控miR-1247-5p的表达影响肝癌细胞增殖、迁移、侵袭目前尚未可知。本研究通过检测LINC00467在肝癌细胞中的表达，初步探究LINC00467对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人不同肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、BEL-7402及正常肝细胞株L02均购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。DMEM、胎牛血清与胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；Transwell小室与基质胶均购自美国Corning公司；LINC00467过表达质粒购自吉凯公司；Lipofectamine®2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；siRNA、miR-1247-5p mimic、miR-1247-5p抑制剂及其各自阴性对照均购自广州锐博生物科技有限公司；Trizol、miScriptⅡRTKit反转录试剂盒及实时荧光定量(qRT-PCR)试剂盒均购自美国Promega公司；噻唑蓝(MTT)试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、MMP-14抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2细胞转染及分组 不同肝癌细胞及正常肝细胞均培养于DMEM培养基，所用培养基含有100 ml/L胎牛血清，放置在温度为37℃、体积分数为5%CO2培养箱，将生长良好的HepG2细胞以每孔1.5×105个细胞的密度接种于6孔细胞板，用对照序列(si-NC)与si-LINC00467进行细胞转染，分别为si-NC组、si-LINC00467组；用miR-NC与miR-1247-5p mimic转染细胞，分别为miR-NC组、miR-1247-5p组；用LINC00467过表达质粒及其空载质粒转染细胞，分别为pcDNA-LINC00467组、pcDNA组；用anti-miR-1247-5p与anti-miR-NC转染si-LINC00467组细胞，分别为si-LINC00467+anti-miR-1247-5p组、si-LINC00467+anti-miR-NC组。所有操作需严格按照Lipofectamine®2000转染试剂盒说明书操作，转染12 h后更换新鲜培养基，继续培养48 h后收集各组对数生长期细胞用于后续实验。

1.3qRT-PCR检测细胞中 LINC00467、miR-1247-5p表达水平 LINC00467、miR-1247-5p相对表达量检测均需采用Trizol法提取各组细胞总RNA，参照反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，所有引物序列由华大基因生物科技有限公司设计合成。qRT-PCR条件为95℃ 5 min，循环1次，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复循环数为40次。收集各孔阈值(Ct)，LINC00467、miR-1247-5p均以U6为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算LINC00467、miR-1247-5p相对表达量。

1.4Western印迹检测CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表达 按照1.2分别处理细胞后，加入RIPA裂解液裂解细胞，30 min后12 000 r/min离心10 min(温度为4℃)，收集上清并采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，电泳反应分为积层胶(80 V 40 min)与分离胶(120 V 1.5 h)，电泳结束后将分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温封闭1 h后分别加入各蛋白一抗(稀释比1∶500)，置于4℃冰箱内孵育过夜，TBST洗膜后分别加入二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h后TBST洗膜，电化学发光法(ECL)显影并曝光，放入凝胶成像分析系统并应用Scion Image软件分析各蛋白条带灰度值。

1.5荧光素酶报告基因检测 通过生物信息学软件预测miR-1247-5p在LINC00467上的结合位点，采用PCR扩增此结合位点，将扩增片段插入pMIR-REPORT载体构建LINC00467野生型质粒(WT-LINC00467)；采用基因突变技术结合位点进行突变，构建LINC00467突变型质粒( MUT-LINC00467)。分别将WT-LINC00467、MUT-LINC00467与miR-1247-5p mimic共转染细胞，采用荧光素酶检测试剂盒检测各组细胞荧光素酶活性。

1.6MTT检测细胞增殖 将各组对数生长期HepG2细胞接种于96孔细胞培养板(1×103个细胞/孔)，每组设置6个复孔，分别于培养24、48、72 h向每孔分别加入浓度为5 mg/ml的MTT溶液10 μl，室温孵育4 h，弃上清，每孔分别加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，振荡充分混匀后置于酶标仪检测各组在波长为490 nm处的光密度(OD)值。

1.7Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 取各组对数生长期HepG2细胞，不含胎牛血清DMEM培养基重悬细胞(密度为5×104)，取200 μl细胞悬浮液加入Transwell小室的上室，取500 μl含胎牛血清DMEM培养基加入Transwell小室的下室，孵箱内培养24 h后弃上层培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，用多聚甲醛(4%)固定20 min，用棉签除去上层液体，结晶紫染色，10 min后用PBS洗涤，置于显微镜下随机选取5个视野拍照并计算迁移细胞数，实验重复3次。细胞侵袭实验：按照1∶8比例用不含胎牛血清DMEM培养基稀释基质胶，基质胶铺于Transwell小室上室，按80 μl/孔密度包被Transwell小室底部膜，其余步骤同细胞迁移实验。每组实验均设置3次重复。

1.8统计学处理 应用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1LINC00467和miR-1247-5p在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达 不同肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402中LINC00467相对表达量明显高于正常肝细胞株L02(P<0.05)，而miR-1247-5p相对表达量明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 LINC00467和miR-1247-5p在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达

肝癌HepG2细胞中LINC00467相对表达量最高，miR-1247-5p相对表达量最低，因此后续研究中将以肝癌HepG2细胞为主要研究材料。

2.2抑制LINC00467表达对肝癌HepG2细胞增殖的影响 Western印迹检测结果发现si-LINC00467组LINC00467相对表达量明显低于si-NC组(P<0.05)，48 h与72 h时HepG2细胞OD值明显低于si-NC组(P<0.05)，见表2。si-LINC00467组HepG2细胞中CyclinD1蛋白表达较si-NC组显著下调(P<0.05)，而p21与p27蛋白表达显著上调(P<0.05)。见图1，表3。

表2 抑制LINC00467表达对肝癌HepG2细胞增殖的影响

图1 增殖相关蛋白表达

表3 抑制LINC00467表达对肝癌HepG2细胞增殖相关蛋白表达的影响

2.3抑制LINC00467表达对肝癌HepG2细胞迁移、侵袭的影响 Transwell实验结果显示抑制LINC00467表达后，HepG2细胞迁移及侵袭数较si-NC组明显降低(P<0.05)，Western印迹检测结果显示，si-LINC00467组HepG2细胞中MMP-2、 MMP-9、MMP-14蛋白表达相较于si-NC组明显降低(P<0.05)，见图2、图3、表4。

图2 迁移、侵袭相关蛋白表达

图3 肝癌HepG2细胞的迁移、侵袭(结晶紫染色，×200)

2.4miR-1247-5p过表达对肝癌HepG2细胞增殖、迁移、侵袭的影响 qRT-PCR检测显示，miR-1247-5p组miR-1247-5p表达水平明显高于miR-NC组(P<0.05)。MTT检测结果显示miR-1247-5p组48、72 h HepG2细胞OD值明显降低(P<0.05)；Transwell实验结果显示miR-1247-5p组HepG2细胞迁移及侵袭数均明显降低(P<0.05)；Western印迹显示miR-1247-5p组HepG2细胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均明显降低(P<0.05)，而p21蛋白表达明显升高(P<0.05)，见表5，表6，图4。

表6 miR-1247-5p过表达对肝癌HepG2细胞增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

图4 miR-1247-5p过表达的增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

2.5LINC00467靶向调控miR-1247-5p的表达 通过生物信息预测显示LINC00467上存在miR-1247-5p的结合位点(图5)，采用荧光素酶报告实验验证LINC00467与miR-1247-5p的靶向关系，结果显示miR-1247-5p mimic可显著降低WT-LINC00467荧光素酶活性(P<0.05)，结合位点突变后miR-1247-5p mimic对LINC00467质粒荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)，见表7。Western印迹检测结果显示，相较于si-NC组(1.01±0.09)，si-LINC00467组miR-1247-5p表达水平(3.16±0.28)明显升高(P<0.05)；相较于pcDNA组(1.03±0.08)，pcDNA-LINC00467组miR-1247-5p表达水平(0.34±0.04)明显降低(P<0.05)。

2.6抑制miR-1247-5p表达逆转了抑制LINC00467表达对肝癌HepG2细胞增殖、迁移、侵袭的作用 与si-LINC00467+anti-miR-NC组相比，qRT-PCR显示si-LINC00467+anti-miR-1247-5p组HepG2细胞中miR-1247-5p相对表达量明显降低(P<0.05)；MTT检测显示HepG2细胞48、72 h OD值、迁移及侵袭细胞数均明显增加(P<0.05)；Western印迹检测显示HepG2细胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均明显升高(P<0.05)，而p21蛋白表达明显降低(P<0.05)，见图6，表8，表9。

图5 LINC00467的序列中含有与miR-1247-5p互补的核苷酸序列

表7 双荧光素酶报告实验

1～4：si-NC组、si-LINC00467组、si-LINC00467+anti-miR-NC组、si-LINC00467+anti-miR-1247-5p组图6 抑制miR-1247-5p的增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

3 讨 论

肝癌具有恶性程度高等特点，由于肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的机制尚未完全阐明导致肝癌进展快及复发转移率高〔9〕。研究显示肝癌发生及发展过程中lncRNA发挥重要作用〔10〕。随着现代生物技术的进步，从分子水平上寻找新型分子标志物及肝癌治疗靶点成为新方向。

LINC00467在结直肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤中呈高表达并可促进肿瘤细胞增殖及迁移，并可能作为临床早期诊断及评估患者预后的重要分子标志物〔11～13〕。然而，LINC00467在肝癌中的作用研究鲜有报道，本研究结果说明LINC00467表达水平升高可能是诱导肝癌发生的原因之一，提示LINC00467可能通过调控某些基因转录后水平进而发挥促癌作用。研究表明LINC00467在非小细胞肺癌细胞中呈高表达并可促进细胞增殖及侵移转移，沉默LINC00467表达可抑制癌细胞恶性增殖并可为靶向治疗非小细胞肺癌提供潜在靶点〔14,15〕。本研究结果表明抑制LINC00467表达后肝癌HepG2细胞增殖活性明显降低，细胞增殖相关蛋白CyclinD1蛋白表达明显降低，而p21与p27蛋白表达明显升高，其中CyclinD1能够与细胞周期依赖性蛋白结合并促使细胞核转录因子从细胞质进入细胞核进而促进细胞增殖，p21与p27可抑制CyclinD1与细胞周期依赖性蛋白结合并诱导细胞周期阻滞进而抑制细胞增殖〔16〕。提示沉默LINC00467表达可能通过上调p21、p27蛋白表达并抑制CyclinD1蛋白表达进而抑制肝癌细胞增殖。Transwell细胞迁移及侵袭实验结果表明，肿瘤细胞迁移及侵袭的物质基础是细胞外基质降解，MMP-2激活后可促进MMP-9、MMP-14活化进而促进肿瘤细胞迁移及侵袭过程〔17〕。说明抑制LINC00467表达可能通过抑制MMP-2、MMP-9、MMP-14活化进而降低肝癌细胞迁移及侵袭能力。提示肝癌细胞中LINC00467表达水平升高可通过调节细胞增殖、迁移及侵袭蛋白表达而发挥癌基因作用。

原发性肝癌患者血清中miR-1247-5p表达水平显著降低，并可能作为肝癌早期诊断的重要指标〔18〕。乳腺癌患者组织及细胞中miR-1247-5p均呈低表达并与患者预后不良密切相关，上调miR-1247-5p表达可能通过调控DVL1/Wnt/β-catenin信号通路进而抑制肿瘤细胞生长，同时miR-1247-5p还与去势抵抗性前列腺癌发生及发展密切相关〔19,20〕。本研究结果提示上调miR-1247-5p 表达可通过抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达并上调 p21蛋白表达进而抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭。双荧光素酶报告基因检测显示LINC00467可靶向调控miR-1247-5p表达即LINC00467可通过竞争性吸附miR-1247-5p从而促使其表达水平降低。为了验证LINC00467是否通过负向调节miR-1247-5p而发挥作用，本研究将沉默miR-1247-5p表达，将其与LINC00467 siRNA共同转染入肝癌HepG2细胞，结果提示抑制miR-1247-5p表达逆转了抑制LINC00467表达对肝癌HepG2细胞增殖、迁移、侵袭的作用。

综上，肝癌细胞中LINC00467高表达，miR-1247-5p低表达，LINC00467可通过抑制miR-1247-5p表达进而促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭，可为后续深入研究肝癌发生及发展的作用机制提供基础依据，并可为临床诊断及治疗肝癌提供有效靶点。然而，关于LINC00467竞争性吸附miR-1247-5p并抑制其表达后又是如何调控疾病进展相关信号通路表达仍需深入研究。