LncRNA NEAT1调控miR-217对高糖诱导血管内皮细胞的作用机制

徐成阳 段红艳 李明艳

(河南省人民医院暨郑州大学人民医院国际医疗中心一病区，河南 郑州 450003)

血糖变化引起的血管内皮受损是动脉粥样硬化性病变的原因，而动脉粥样硬化是糖尿病(DM)血管并发症的病理基础，DM血管并发症可导致患者致死、致残〔1，2〕。研究DM血管并发症的发生机制，针对发病机制为靶点的治疗有助于DM慢性并发症的防治〔3〕。研究发现长链非编码RNA(lncRNA)与血管内皮细胞病理性增殖及脂代谢相关，在DM及其血管并发症中具有重要作用〔4〕。核旁丛组装转录本1(NEAT1)是一个非编码RNA，研究发现抑制NEAT1通过靶向miR-204和调节核转录因子(NF)-κB途径减轻了脂多糖(LPS)诱导的细胞损伤〔5〕。上调NEAT1有助于神经保护机制抵抗神经元损伤〔6〕。沉默NEAT1可减弱血管平滑肌细胞增殖和迁移〔7〕。微小RNA(miRNA)参与调控DM及相关疾病〔8〕。miR-217通过调控SIRT1参与高糖诱导的内皮细胞凋亡〔9〕。过表达miR-217还可促进人皮肤成纤维细胞的衰老〔10〕。然而lncRNA NEAT1对高糖诱导血管内皮细胞的影响及其机制是否与miR-217有关还尚未清楚。本实验旨在研究lncRNA NEAT1对高糖诱导血管内皮细胞的影响及其机制是否与miR-217有关。

1 材料与方法

1.1材料 人脐静脉内皮细胞株EAhy926(上海细胞库)；DMEM培养基(美国Hyclone)；Trizol试剂、荧光定量试剂盒(美国Progema)；RIPA蛋白裂解液(上海碧云天)；细胞计数试剂盒(CCK)-8、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京Solarbio)；载体质粒(上海伯易生物)。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组 EAhy926细胞常规培养在DMEM培养液中，用终浓度为25 mmol/L葡萄糖的培养液培养细胞24 h作为高糖(HG)组，正常培养的细胞作为对照(NG)组；将pcDNA、pcDNA-NEAT1、anti-miR-con、anti-miR-217转染至高糖处理的EAhy926细胞中，计为HG+pcDNA组、HG+pcDNA-NEAT1组、HG+anti-miR-con组和HG+nti-miR-217组；将pcDNA-NEAT1与miR-con、miR-217分别共同转染至高糖处理的EAhy926细胞中，记为HG+pcDNA-NEAT1+miR-con组、HG+pcDNA-NEAT1+miR-217组。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-217和NEAT1的表达水平 提取总RNA，反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒说明进行PCR，miR-217和NEAT1分别以U6和β-actin为内参，用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.2.3Western印迹检测细胞周期素(Cyclin)D1、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3蛋白表达 提取细胞总蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜后用5 %脱脂奶粉封闭，加入一抗4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，显影、定影，分析蛋白条带的吸光度，β-actin为参照计算蛋白表达水平。

1.2.4CCK-8检测细胞存活率 各组细胞培养48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃培养2 h。酶标仪上检测490 nm波长的吸光度(OD)值。以NG为对照计算细胞存活率。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，漂洗后加入500 μl结合缓冲液重悬；然后分别加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混匀、避光孵育10 min；上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6荧光素酶报告基因检测实验检测NEAT1对miR-217的靶向调控 将NEAT1野生型和突变型荧光素酶表达载体分别与miR-con和miR-217共转染至EAhy926细胞，按照说明书进行检测。将pcDNA、pcDNA-NEAT1、si-con、si-NEAT1分别转染至正常EAhy926细胞中，用RT-qPCR检测miR-217表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS20.00软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1高糖诱导对人脐静脉内皮细胞中NEAT1和miR-217表达的影响 与NG组相比，HG组人脐静脉内皮细胞中NEAT1表达水平显著降低，miR-217表达水平显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 NEAT1和miR-217在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞中表达

2.2过表达NEAT1和高糖诱导对人脐静脉内皮细胞增殖的影响 与NG组相比，HG组人脐静脉内皮细胞中NEAT1、CyclinD1表达水平显著降低，细胞存活率显著降低(P<0.05)；与HG+pcDNA组相比，HG+pcDNA-NEAT1组NEAT1、CyclinD1表达水平显著升高，细胞存活率显著升高(P<0.05)。见图1，表2。可见，过表达NEAT1促进高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖。

1～4：NG组、HG组、HG+pcDNA组、HG+pcDNA-NEAT1组图1 Western印迹检测人脐静脉内皮细胞CyclinD1表达

表2 过表达NEAT1和高糖诱导对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

2.3过表达NEAT1和高糖诱导对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响 与NG组相比，HG组人脐静脉内皮细胞中Cleaved caspase-3表达水平及凋亡率显著升高(P<0.05)；与HG+pcDNA组相比，HG+pcDNA-NEAT1组Cleaved caspase-3表达水平及凋亡率显著降低(P<0.05)。见图2，表3。可见，过表达NEAT1抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。

图2 过表达NEAT1和高糖诱导对人脐静脉内皮细胞凋亡及Cleaved caspase-3表达的影响

表3 过表达NEAT1和高糖诱导对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

2.4NEAT1靶向miR-217调控其表达 Targetscan预测显示NEAT1与miR-217存在结合位点见图3。miR-217与WT-NEAT1共转染的EAhy926细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，见表4。si-NEAT1组miR-217表达量(0.68±0.03)明显低于si-con组(1.01±0.01)，pcDNA-NEAT1组miR-217表达量(0.44±0.06)明显低于pcDNA组(0.94±0.09)，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

图3 NEAT1靶向miR-217

表4 双荧光素酶报告实验

2.5干扰miR-217和高糖诱导对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响 与HG+anti-miR-con组相比，HG+anti-miR-217组CyclinD1表达水平及存活率明显升高，cleaved caspase-3表达水平及细胞凋亡率降低(P<0.05)。见表5，图4。可见，干扰miR-217促进高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖，抑制细胞凋亡。

1、2：HG+anti-miR-con组、HG+anti-miR-217组图4 Western印迹检测CyclinD1和cleaved caspase-3蛋白表达

2.6过表达NEAT1和miR-217对高糖诱导人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响 与HG+pcDNA-NEAT1+miR-con组相比，与HG+pcDNA-NEAT1+miR-217组miR-217表达水平明显升高，CyclinD1表达水平及细胞存活率明显降低，cleaved caspase-3表达水平及细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。见图5，表6。可见，过表达miR-217可逆转NEAT1对高糖诱导人脐静脉内皮细胞增殖促进和凋亡抑制的作用。

1、2：HG+pcDNA-NEAT1+miR-con组、HG+pcDNA-NEAT1+miR-217组图5 Western印迹检测CyclinD1和cleaved caspase-3蛋白表达

3 讨 论

DM引起的慢性血管并发症严重影响糖尿病患者的生活质量，危害极大〔11〕。血管内皮细胞损伤与DM血管病变密切相关，高浓度葡萄糖能抑制人脐静脉内皮细胞增殖，促进细胞凋亡〔12〕。lncRNA和miRNA均属于非编码RNA，与DM血管病变疾病密切相关，可为其基因诊断与治疗提供新靶点、新思路、新方法〔13〕。研究发现lncRNA NEAT1通过激活miR-181d-5p/CDKN3轴可抑制氧化应激诱导的血管内皮细胞损伤〔14〕。NEAT1还介导三甲胺N-氧化物诱导的内皮细胞增殖〔15〕。CyclinD1是细胞周期相关蛋白〔16〕；cleaved caspase-3是细胞凋亡蛋白〔17〕，其表达水平影响细胞增殖和凋亡。本研究结果说明过表达NEAT1可抑制高糖诱导的细胞凋亡，促进细胞存活。

研究报道显示高糖诱导血管内皮细胞miR-217表达上调〔18〕，本研究结果表明高糖处理的人脐静脉内皮细胞中miR-217高表达。高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞中，miR-217通过调节Sirt1/HIF-1α通路促进炎症反应及纤维化〔19〕。抑制miR-217通过恢复PTEN介导的自噬途径可预防高葡萄糖诱导的足细胞损伤和胰岛素抵抗〔20〕。本研究结果说明抑制miR-217表达促进细胞增殖，抑制高糖诱导的细胞凋亡。NEAT1可能通过靶向调控miR-217影响高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡。