单唾液酸四己糖-1-神经节苷脂减轻糖尿病脑病模型大鼠脑损伤的机制

刘书芳 汪琳 李月玲 李文雅 王明磊 黄圣明

(漯河市中心医院 漯河医专一附院，河南 漯河 462000)

糖尿病是临床常见的慢性疾病，发病的同时会引起患者多种慢性并发症。糖尿病周围神经病变是临床常见的糖尿病慢性并发症之一，通常在患病的10年内伴有明显的神经病变的症状〔1〕。临床研究发现，60%～90%的糖尿病患者有不同程度的神经病变〔2〕。糖尿病的发病机制十分复杂，由于机体长期处于严重的高血糖状态，使机体出现微循环异常、神经营养因子缺乏、代谢障碍、氧化应激自由基增多和自身免疫紊乱等〔3〕。糖尿病脑病已经成为临床上常见的疾病，因此，对于糖尿病脑病的研究越来越受到人们的关注。单唾液酸四己糖-1-神经节苷脂(GM-1)不仅能提高人体内部免疫因子含量，还对各种损伤性神经具有较强的修复功能和保健作用。一定剂量的GM-1即可促进神经的快速生长，对损伤后的髓鞘具有修复功能，可以有效减少周边神经髓鞘的脱失概率，调节细胞的新陈代谢过程〔4〕。GM-1会转移至神经细胞的细胞器中，参与核酸的合成与代谢，从而调控基因的转录和翻译〔5〕。GM-1主要用于治疗外伤性中枢神经系统损伤、脑血管性中枢神经系统损伤及帕金森病等，并且治疗效果显著〔6〕。神经细胞的凋亡与糖尿病密切相关，保护神经细胞功能是目前防治由糖尿病引起的各种脑组织病变问题的常用手段。内质网(ER)是细胞蛋白质合成的场所，当ER功能发生紊乱时，机体会立即检测出异常状态，并激活细胞的自我保护机制产生ER应激反应〔7〕。合理的ER应激反应能够促进细胞的正常代谢，提高机体的生理功能，但是过度ER应激或超长时间的应激反应会降低细胞的活力，甚至杀死正常细胞〔8〕。所有神经细胞中都含有大量的ER，并对ER的应激反应具有较高的灵敏度，对糖尿病患者的神经细胞进行抽样调查后可以看出ER应激标记物的数量显著增加〔9〕。本研究通过链脲佐菌素建立了大鼠糖尿病脑病模型，检测海马区神经元特异性烯醇化酶(NSE)和S-100B的蛋白表达及海马组织中ER应激相关分子CHOP、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、B淋巴细胞瘤(Bcl-2)和Bcl-2相关X基因(Bax)蛋白表达水平，并对GM-1治疗后的大鼠应激诱导下的细胞凋亡状况与脑组织损伤的相关性进行了探讨。

1 材料与方法

1.1实验材料 筛选60只Wistar大鼠，雄性、SPF级，每只大鼠的重量在190～200 g，采购单位为北京维通利华动物实验公司。神经节苷脂注射液购自齐鲁制药厂。兔抗大鼠NSE多克隆抗体和兔抗大鼠S-100B多克隆抗体购于美国CST公司；CHOP、caspase-3、Bax、Bcl-2、β-actin等抗体购于美国Abcom公司；细胞组织蛋白提取试剂购于上海碧云天生物科技有限公司。实验中采用的成像设备与系统均是从UVP公司采购；蛋白酶检测仪器由BioTek公司生产。

1.2实验方法

1.2.1实验分组及给药 60只大鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组、GM-1组，各20只。链脲佐菌素的注射器件为一次性注射器，注射部位为大鼠的腹腔，注射计量以60 mg/kg为标准，在注射完成后等待48 h，对注射大鼠的血糖水平进行检测，如果检测的血糖含量在16.7 mmol/L以上，即可判定该组大鼠符合脑病模型的构建需求，可以开展后续实验。正常组注射的药物为柠檬酸缓冲剂，注射方式为一次性注射。完成糖尿病模型的构建后，对实验组和观察组的大鼠按照10 mg/kg 的标准，1次/d直至观察时间点。

1.2.2脑脊液GM-1含量的测定 在腹腔注射GM-1后的第3、7、14天后，使用20%乌拉坦麻醉大鼠。麻醉成功后，于大鼠颈后正中切口，暴露环枕膜。找到大鼠小脑的延髓池，从中抽取120 μl的大鼠脑脊液，然后运用光度监测法，结合电子显微镜，对脑脊液中GM-1药物的光吸收能力进行观察，最后依据GM-1标准检测曲线，结合相关计算公式对脑脊液中的GM-1含量进行检测与计算。

1.2.3Western印迹检测大鼠脑组织蛋白水平 在注射实验结束后，首先将3组大鼠处死，并截取头部；然后在冰上迅速分离出大鼠双侧海马组织，使用4℃生理盐水洗涤后，置于液态氮中冻存后，可冷冻于-80℃冰箱待测。大鼠脑组织中的海马体存放在研钵中，并在其中加入合理剂量蛋白裂解液，并完成对脑组织的研磨。将研磨完成的脑组织成分置于冰块上进行30 min的裂解反映后，在4℃的环境中、离心10 min，从裂解后的细胞液中抽取上清部分，并采用BCA蛋白浓度试剂盒对脑组织蛋白含量进行定量处理。

浓缩胶的选取标准为：纯度在5%以上。分离胶的选用标准为：纯胶含量为10%，随后从已经分离出来的担保样品中抽取20 μl的剂量作为样品，在电泳混合完成后，将实验蛋白放置在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜之上。然后采用10%含量的脱脂乳粉溶液对蛋白进行封闭处理，并静置2 h，在1∶1 000的比例和4℃孵育的情况下，应再第二日的上午开展后续实验。洗膜的次数为3次，使用的产品为TBST，吸膜的时间应控制在15 min/次左右，在1∶4 000的比例下，应首先进行2 h的温室孵育，然后采用TBST对膜进行清洗。最后采用化学发光试剂，对实验中的蛋白进行着色处理。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.13组脑脊液GM-1测定 GM-1组大鼠脑脊液内GM-1含量在3、7、14 d均显著高于模型组(P<0.01)，并且含量趋于稳定；对照组和模型组由于未给予外源性的GM-1，但却检测到微量的脑脊液中的GM-1，推测应是内源性神经节苷脂。在所有测试阶段，GM-1组大鼠脑脊液含有的GM-1水平远大于模型组，说明腹腔注射GM-1可以有效提高中枢神经系统局部的GM-1的含量。见表1。

表1 各组腹腔注射后不同时间脑脊液GM-1含量

2.2各组海马组织NSE蛋白表达测定 模型组大鼠的海马组织NSE蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)。与模型组相比，GM-1组大鼠海马组织中NSE蛋白表达显著下调(P<0.05)，说明腹腔注射GM-1可以有效地降低糖尿病脑病引起的NSE蛋白升高。见图1，表2。

图1 各组海马组织NSE蛋白表达

2.3各组海马组织S-100B蛋白表达测定 模型组海马组织S-100B蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)。与模型组相比，GM-1组海马组织S-100B蛋白表达显著下调(P<0.05)，说明腹腔注射GM-1可以有效地降低糖尿病脑病引起的S-100B蛋白升高。大鼠脑部海马组织S-100B的变化规律与 NSE蛋白检测出的变化规律几乎一致。见表2，图2。

图2 各组海马组织S-100B蛋白表达

2.4各组海马组织CHOP蛋白表达测定 模型组海马组织CHOP表达显著高于对照组(P<0.05)，与模型组相比，GM-1组海马组织CHOP蛋白表达量显著下调(P<0.05)，说明腹腔注射GM-1可以有效地降低糖尿病脑病引起的ER应激标志蛋白CHOP表达升高。见表2，图3。

2.5各组海马组织中caspase-3蛋白表达测定 模型组海马组织caspase-3表达显著高于对照组(P<0.05)，与模型组相比，GM-1组海马组织caspase-3蛋白表达显著下调(P<0.05)，说明腹腔注射GM-1可以有效地降低糖尿病脑病引起的caspase-3蛋白表达升高。见表2，图4。

图3 各组海马组织中CHOP蛋白含量的比较

图4 各组海马组织caspase-3蛋白表达

2.6GM-1对海马组织Bax蛋白表达的影响 模型组海马组织Bax的转录水平显著高于对照组(P<0.05)，与模型组相比，GM-1组海马组织Bax转录水平显著下调(P<0.05)，说明腹腔注射GM-1可以有效地降低糖尿病脑病引起的促凋亡基因Bax转录水平的升高。见表2，图5。

图5 各组海马组织Bax蛋白表达

2.7GM-1对海马组织Bcl-2蛋白表达的影响 模型组海马组织Bcl-2的转录水平显著低于对照组(P<0.05)，与模型组相比，GM-1组海马组织抑凋亡基因Bcl-2转录水平显著上调(P<0.05)，说明腹腔注射GM-1可以有效地提高糖尿病脑病引起的抑凋亡基因Bcl-2转录水平的降低。见表2，图6。

图6 各组海马组织Bcl-2蛋白表达

3 讨 论

临床研究发现，61.8%的糖尿病患者伴有神经病变，其中糖尿病脑病是最常见的并发症之一。目前对于糖尿病脑病的具体发病机制还不清楚，多数研究人员认为是由于机体微循环障碍、代谢紊乱及神经营养因子减少等因素导致的〔9〕。

糖尿病患者的血糖含量始终处于较高水平，而高水平的血糖含量会加速细胞的新陈代谢过程，并对一些神经细胞具有死亡促进作用，从而导致神经细胞的传导功能衰退，死亡速度加快。糖尿病对人体的中枢神经阻滞具有较强的侵害作用，会降低大脑神经中枢的工作效率，使脑神经结构和组织发生生理性病变，加速脑细胞的衰老与死亡〔10〕。糖尿病患者存在神经损伤问题的根本原因在于其体内血糖含量的上升，两者之间存在正相关性。GM-1属于神经糖鞘脂类，生存的空间仅限于神经元细胞膜中，能够对人体起到神经信号传导作用〔10〕。研究表明，由外部注入体内的GM-1可以有效促进神经因子的生长，并诱导内源性神经因子的重新发育，GM-1对脑组织中轴的突膜具有良好的刺激作用，能够激活突膜区域的蛋白酶，对神经信号的传导具有增益效果，对神经性损伤具有一定的修复作用〔11〕。

海马区域是大脑中具有学习记忆功能的重要神经中枢部位，海马区域受损会使患者出现严重的脑损伤，并伴有严重的记忆功能障碍。NSE和S-100B是大脑海马组织中与脑损伤相关的神经元特异性标志物，对海马体脑组织神经损伤问题的研究始终是学术界重点关注的课题。NSE在脑中枢神经损伤的治疗方面具有较高的特殊性，与其他药物的差异主要集中在神经元细胞与内分泌细胞中的药物含量，因此可以作为神经细胞损伤的重要标志物。S-100B是一种细胞溶质钙结合蛋白，在细胞中的含量十分丰富，主要分布于雪旺细胞和神经胶质细胞中。当脑组织发生损伤后，被激活的星形胶质细胞会产生大量的S-100B，并对星形胶质细胞的激活产生正反馈调节。S-100B蛋白过表达会导致神经毒作用，从而对脑组织中的神经元细胞、胶质细胞产生死亡诱导作用，使这些细胞走向死亡。NSE和S-100B是中枢神经系统中的标志性蛋白，分别以神经元和神经胶质细胞为主〔7〕。本研究结果说明在糖尿病脑病的发病机制中，大鼠海马组织的神经元及神经胶质细胞均受到了明显损伤，推测GM-1对糖尿病脑病大鼠脑部的神经损伤起明显的保护作用，NSE和S-100B可以作为糖尿病脑病病情程度评估的指标。

本研究结果说明GM-1在注射进大鼠体内后，可以由CHOP途径来降低神经细胞死亡，延长细胞衰老的时间。同时，本研究还发现，采用GM-1进行糖尿病脑病的治疗，可以使caspase-3的水平大幅降低，由此可以推测出GM-1对神经细胞的凋亡具有抑制作用，对糖尿病脑病具有较强的疗效。此外，本研究结果还进一步证实CHOP的过表达和积聚会使促凋亡基因Bax上调，抗凋亡基因Bcl-2下调，当Bcl-2/Bax的比值降低后，会导致细胞发生凋亡。本研究结果提示GM-1主要是利用对CHOP蛋白表达强度的降低，来实现对线粒体传播途径的阻断，使神经细胞在较短的时间内凋亡，从而加速了人体的衰老过程。