老年宫颈癌HPV感染亚型及抑癌基因p53、p16、pRb表达

来正伟 王华斌 陈建亮 温达静 (杭州市萧山区第一人民医院妇科，浙江 杭州 311200)

宫颈癌(CC)作为妇产科常见恶性肿瘤，随着宫颈细胞学筛查的应用，该病发病率、死亡率有一定降低，但流行病学调查显示，CC发病现愈发趋于年轻化〔1〕。人乳头瘤病毒(HPV)感染是诱发CC的主要原因，研究显示，HPV感染过程分为潜伏期、亚临床期、症状期、肿瘤期4个阶段，而不同HPV亚型感染过程进展各异，其中高危型HPV持续感染可能会加速CC进展，增加预后风险〔2,3〕。因此，明确老年CC患者HPV感染亚型，对指导早期干预意义重大。p53、p16、pRb是近年来肿瘤组织中发现的抑癌基因，研究发现，上述基因可紊乱肿瘤细胞周期，降低蛋白激酶活性，促进肿瘤细胞凋亡，预防肿瘤细胞增殖〔4〕。陈丽等〔5〕研究显示，尖锐湿疣HPV16/18感染患者p53、p16、pRb表达低于HPV16/18阴性患者，且p53、p16、pRb表达可预测癌变风险。由此猜测，p53、p16、pRb表达可能与老年CC患者HPV感染亚型存在一定关系，但目前相关研究较少。鉴于此，本研究通过观察老年CC组织中抑癌基因p53、p16、pRb表达情况，分析抑癌基因p53、p16、pRb表达与老年CC患者HPV感染亚型的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾收集杭州市萧山区第一人民医院2005年12月至2018年9月经病理组织确诊并完成治疗、随访的140例老年HPV感染CC患者癌组织标本。纳入标准：患者均符合《宫颈癌及癌前病变病理诊断规范》〔6〕中CC相关诊断标准，且经病理检查证实；均经细胞病理学检查提示HPV感染。(2)排除标准：合并感染性疾病；合并其他恶性肿瘤；伴心肝肾等重要脏器相关疾病；合并其他宫颈疾病。140例患者年龄62～77岁，平均(69.50±2.34)岁；体重指数(BMI)17.6～24.9 kg/m2，平均(21.22±1.04)kg/m2；病理类型：鳞癌83例，腺癌32例，腺鳞癌25例；临床分期：Ib1期21例，Ib2期53例，Ⅱa期66例；分化程度：低分化32例，中分化65例，高分化43例。本研究的实施符合伦理委员会相关标准，患者标本组织、临床资料等均完整。

1.2方法

1.2.1HPV感染亚型检测及分组 将裂解、冻存的细胞液置于室温下溶解后，采用HPV分型检测试剂盒分离、提取标本组织DNA，并对标本DNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增及杂交，采用HPV扩增分型检测试剂盒测定HPV分型，主要包括高危型(HPV16、18、31、35、45等)、低危型(HPV6、11、30、39等)两种；将高危型HPV感染患者纳入高危型组，反之则纳入低危型组。

1.2.2抑癌基因p53、p16、pRb检测 取患者病理组织标本，采用荧光定量PCR法测定抑癌基因p53、p16、pRb表达；PCR法检测：将裂解、冻存的细胞液置于室温下溶解后，先对标本进行两项分离，提取标本RNA并置于水箱中，沉淀、清洗后将干燥的RNA溶解并获取对应溶液，置于-80℃超低温冰箱内储存；采用紫外吸收法检测RNA溶液纯度，然后合成cDNA样品，对合成样本进行逆转录反应，反应体系分为包括缓冲液2 μl、dNTP 0.1 μl、焦碳酸二乙酯(DEPC)水5 μl、MMLV 0.5 μl、RNA模板2 μl、上游引物0.2 μl、下游引物0.2 μl；先绘制待检抑癌基因PCR标准曲线，然后进行定量PCR检测；扩增反应条件为：先于93℃环境下变性2 min，然后分别于93℃、55℃、72℃环境下变性1 min，设定40个循环，最后在72℃环境下延伸7 min；根据目标基因选取对应引物序列，取正常宫颈组织为对照，并设定各抑癌基因表达量为100，测定CC组织中p53、p16、pRb表达量。

1.3统计学方法 采用SPSS23.0软件进行t检验、χ2检验、秩和检验、Logistic回归分析。

2 结 果

2.1老年CC患者HPV感染亚型情况 140例老年CC患者中128例(91.43%)高危型HPV感染；其中HPV16感染64例(50.00%)、HPV18感染43例(33.59%)；HPV31感染12例(9.37%)；其他9例(7.04%)。

2.2不同 HPV感染亚型老年CC患者相关基线资料比较 高危型HPV感染组抑癌基因p53、p16、pRb表达均明显低于低危型组(P<0.05)；组间其他基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3抑癌基因p53、p16、pRb对老年CC患者HPV感染亚型的影响分析 将抑癌基因p53、p16、pRb作为自变量(均为连续变量)，将老年CC患者HPV感染亚型作为因变量(1=高危型，0=低危型)，经二元Logistic回归分析检验结果显示，抑癌基因p53、p16、pRb低表达均可能是老年CC患者高危型HPV感染的影响因素(P<0.05)。见表2。Logistic多元回归分析：将老年CC患者HPV感染亚型作为因变量(1=高危型，0=低危型)，同时纳入年龄、BMI等基线资料，建立Logistic多元回归模型，在校正年龄、BMI等带来的影响后，结果显示，抑癌基因p53、p16、pRb低表达均是老年CC患者高危型HPV感染的影响因子(OR>1，P<0.05)。见表3。

表2 抑癌基因p53、p16、pRb对老年CC患者HPV感染亚型的影响二元Logistic回归分析结果

表3 抑癌基因p53、p16、pRb对老年CC患者HPV感染亚型的影响Logistic多元回归分析结果

3 讨 论

目前已经发现的HPV亚型有200多种，其中有30多种HPV亚型与CC发生、发展存在一定关系，但研究显示，不同亚型HPV致病力存在差异〔7〕。据报道，持续性高危型HPV感染不仅会使宫颈上皮细胞发生癌前病变，诱发CC，还将加速肿瘤细胞增殖，促进肿瘤转移〔8〕。因此，明确老年CC患者HPV感染亚型，对指导临床干预尤为必要。

随着病理组织学的深入研究，有报道指出，CC患者HPV感染亚型与癌基因表达密切相关〔9〕。p53是生物体内重要抑癌基因，主要分为突变型、野生型2种，其中突变型基因有致癌作用，而野生型则具有抑癌作用〔10〕。野生型p53可监视细胞基因结构情况，及时诱导异常DNA细胞凋亡，继而清除有癌变倾向的细胞，发挥抑癌作用〔11〕。相关研究显示，野生型p53基因丢失会导致宫颈上皮细胞异常分化、增殖，诱发上皮细胞癌变，同时HPV感染后病毒DNA中E6会结合p53，导致野生型p53活性降低，继而增强HPV致病力，促进疾病发展〔12〕。G1/S是真核细胞分裂、增殖主要细胞周期调控点，该点有多条调控途径，可维持细胞正常分裂及增殖，其中pRb是G1/S调控中心环节〔13〕。研究显示，HPV感染后病毒DNA中E7、CyclinD1-CDK4复合物等会竞争性结合pRb，使其磷酸化，进而降低pRb活性，造成细胞异常分裂，加重疾病发展〔14〕。p16是一种细胞周期调节因子，在多种细胞周期调控环节中均起到“闸”作用，据报道，p16可竞争性结合CDK4，抑制CDK4活性，预防pRb磷酸化，维持pRb调节作用，确保细胞正常分裂〔15〕。另有动物研究显示，pRb活性与p16表达存在一定关系，pRb活性降低会负反馈刺激p16基因，导致p16表达异常〔16〕。

本研究结果提示高危型HPV感染老年CC患者的抑癌基因p53、p16、pRb多呈低表达；抑癌基因p53、p16、pRb低表达与老年CC患者高危型HPV感染有一定关系。分析原因在于，机体细胞中致癌基因与抑癌基因相互制衡，维持细胞周期平衡性，预防肿瘤细胞生成，但当抑癌基因p53、p16等低表达可能会导致致癌基因过表达，损伤细胞DNA，且可激活G1/S环节中调控蛋白，造成损伤细胞异常增殖，促使HPV生成病毒癌蛋白，继而增强HPV致病力，推进疾病发展，继而增加高危型的感染风险〔17，18〕。但因宫颈癌患者几乎超过90%HPV感染均为高危型，故本研究结果并不能直接证实各个抑癌基因的低表达是直接导致老年宫颈癌患者高危型HPV感染的风险因子，加之研究选取的是全部确诊为宫颈癌的患者，故抑癌基因的低表达也可能是因感染导致，故二者之间的因果关系，还需要在未来进一步纳入其他宫颈病变及宫颈上皮内瘤变的老年HPV感染患者进行研究，进一步证实二者的关系。

综上，老年CC患者多为高危型HPV感染，且抑癌基因p53、p16、pRb多呈低表达，抑癌基因p53、p16、pRb低表达可能是老年CC患者高危型HPV感染的风险因素，临床应据此提出针对性干预方案，以指导老年宫颈病变患者早期合理干预，以预防高危型HPV感染致CC的发生。