15-二氘脱水穿心莲内酯的合成和氢-氘交换速率考察

2021-09-01霍志鹏

合成化学 2021年8期

霍志鹏, 刘迪, 邱峰

(天津中医药大学中药学院组分中药国家重点实验室，天津 301617)

近年来氘代药物逐渐成为新药研发的热点之一，氘代药物因氘(D)元素的同位素效应，有减缓药物代谢、改善药代动力学、减少毒性代谢产物以及抑制药物间的相互作用等优势。在原有上市药物或活性成分基础上进行氘代设计为常用策略，在保持原药物疗效的基础上，有望改善该药的代谢特性，降低用药剂量，发挥更稳定的治疗作用[1-2]。稳定同位素标记药物在生物样品检测中作为内标也有广泛的应用，在《中国药典》2020年版通则“9012 生物样品定量分析方法验证指导原则”中推荐生物样品质谱检测时，尽可能使用稳定同位素标记的内标[3]。脱水穿心莲内酯(穿心莲丁素)为穿心莲Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees的主要活性成分之一，现代药理研究显示，脱水穿心内酯和其衍生物具有具有抗炎、抗癌以及抗病毒等药理活性[4-6]。

Scheme 1

本研究合成了脱水穿心莲内酯15-位两个氘原子取代的15-二氘脱水穿心莲内酯，并考察了其在不同pH下的H-D交换速率，以期为脱水穿心莲内酯和其衍生物的氘代药物合成提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker Advance 400 MHz型核磁共振仪(TMS为内标)；LC-IT-TOFMS型液相联用离子阱飞行时间质谱仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2 15-二氘脱水穿心莲内酯的合成

量取四氢呋喃10 mL，加入无水亚硫酸2.0 g，振摇1 min，静置24 h后取上层除水的四氢呋喃备用。将上述四氢呋喃2 mL和氧化氘1 mL混匀，加入脱水穿心内酯(1) 30 mg，三乙胺50 μL，60 ℃反应4 h。减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(洗脱剂：二氯甲烷/乙酸乙酯=1/0～4/1,V/V)层析纯化，收集(二氯甲烷/乙酸乙酯=4/1,V/V)主要流分，旋蒸浓缩蒸干后得白色粉末状固体(A)21 mg。

15-二氘脱水穿心莲内酯(A): 白色粉末状固体，收率70%;1H NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 7.63(brs, 1H), 6.75(dd,J=15.8 Hz, 10.1 Hz, 1H), 6.13(d,J=15.8 Hz, 1H), 4.87(brs, 0.05H), 4.73(brs, 1H), 4.42H(brs, 1H), 3.85(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.27(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.22(m, 1H), 1.10(s, 3H), 0.76(s, 3H)；13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 172.5, 148.9, 146.6, 134.3, 127.3, 121.3, 108.1, 78.6, 69.8, 62.6, 60.6, 53.8, 42.4, 38.3, 38.0, 36.3, 27.6, 27.6, 23.0, 15.5; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C20H26D2O4{[M+Na]+}357.2005, found 357.1993。

脱水穿心莲内酯(B)：白色粉末状固体，收率85%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.65(brs, 1H), 6.75(dd,J=15.8 Hz, 10.1 Hz, 1H), 6.13(d,J=15.8 Hz, 1H), 4.89(brs, 2H), 4.73(brs, 1H), 4.42H(brs, 1H), 3.84(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.27(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.22(m, 1H), 1.10(s, 3H), 0.76(s, 3H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 172.4, 148.9, 146.8, 134.3, 127.1, 121.3, 108.1, 78.5, 70.2, 62.6, 60.6, 53.8, 42.4, 38.3, 38.0, 36.3, 27.6, 27.6, 23.0, 15.5; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C20H28O4{[M+Na]+}355.1880, found 350.1886。

1.3 15-二氘脱水穿心莲内酯在不同pH缓冲溶液中氘代的交换速率

用磷酸二氢钾、磷酸氢二钠分别配置成0.067 mol·L-1的pH 分别为6、 7和 8的磷酸缓冲液。用碳酸钠、碳酸氢钠配置成0.1 mol·L-1的pH为10的缓冲液。取反应产物用甲醇配置成0.1 mg·mL-1溶液，分别取1 mL 15-二氘脱水穿心莲内酯溶液，与上述pH分别为6， 7， 8和10的缓冲液1 mL混合，摇匀。室温放置，分别于不同的时间用LC-IT-TOFMS检测氘元素保留速率。

2 结果与讨论

2.1 合成条件的选择

脱水穿心莲内酯在水中难溶，本研究采用了无活性质子溶剂非氘代四氢呋喃作为辅助溶剂以使脱水穿心莲内酯全部溶解。结果显示，四氢呋喃中的H在反应中无明显的H-D交换，产物脱水穿心莲内酯-d2在15-氘代比例大于85%，在反应产物的硅胶柱纯化中使用的二氯甲烷和乙酸乙酯也为非氘代试剂。使用非氘代溶剂在H-D交换反应中助溶，可节约试剂成本。

2.2 15-二氘脱水穿心莲内酯的结构表征

反应原料脱水穿心莲内酯与文献报道的脱水穿心莲内酯特征一致[7]，反应产物和脱水穿心莲内酯相比，15-H信号明显降低，积分仅为0.05个H[8]， 15-C信号因和两个磁不等价D核耦合裂分，明显降低，D核量子自旋数为1，单个D核取代产生(2nI+1)=3重裂分[9-11]，两个磁不等价D核理论上可对15-C可形成(2nI+1)×(2nI+1)=9重裂分，文中13C NMR图谱因裂分后峰高降低较多，受基线噪音干扰，未观察到裂分的细微结构(见图1和2)。反应产物15-C信号向高场移动了0.4 ppm，和文献报道的D元素同位素效应引起的位移变化方向一致[10-12]。

文献报道碱催化用于羰基邻位(α-位) C—H 键氢氘交换，因羰基的吸电子作用，酸性增强，在碱性催化下可与氘代水(氧化氘)发生氢氘交换[13-15]。脱水穿心莲内酯15-H为α，β-不饱和羰基的γ-位，本研究通过碱催化合成了15-二氘的脱水穿心莲内酯，表明羰基的吸电子作用可通过共轭的π键影响γ-位，使γ-位的酸性增强。脱水穿心莲内酯7-H为烯键的临位，反应产物中未发现7-H的氘代，提示单一烯键的α-位酸性较α，β-不饱和羰基中烯键的临位弱。C—H键的氘代速率一定程度上反映了该位点氢解离能力。氘代后化合物在氘代位置的1H NMR谱和13C NMR在对应位置有明显变化，H信号降低或消失，在全去耦合碳谱的中由于不能完全去掉D核对13C核的耦合，C—D连接的碳谱信号因D核的裂分降低。化合物的氘代对化学特性和结构鉴定研究也有一定的辅助作用。

2.3 15-二氘脱水穿心莲内酯在不同pH缓冲溶液中氘代的交换速率

两个15-D取代时质谱上信号较原化合物m/z增加2，一个氘原子取代时，质谱信号较原化合物m/z增加1。因C13自然丰度较高，原化合物存在天然的+1和+2的同位素信号，计算氘原子比例应将天然同位素丰度的影响考虑在内。15-二氘脱水穿心莲内酯内酯在pH 分别为6， 7和8的溶液中0， 2， 4， 8， 12， 20和192 h的15-氘原子保留比例见表1，在20 h内上述3个pH值溶液的保留比例无明显降低，在192 h， pH为6的氘原子比例变化不明显，pH为7的保留比例为77.4%， pH为8的保留比例为49.1%。 pH为10溶液中0～20 h的D原子保留比例见图3，在pH为10溶液中氘原子比例降低较快，4 h降低至45%， 20 h降低至1.7%。脱水穿心莲内酯15-H与D交换速率在接近中性的溶液中交换速率较慢，随pH升高交换速率加快。