反硝化微生物燃料电池脱除低C/N废水中氮的研究*

贾 婧 彭俊霖 王一靖 李 杨 李筱晗 吴文斌 付树森 袁青彬

(南京工业大学环境科学与工程学院，江苏 南京 211816)

近年来，我国地表水和很多生活污水均呈现有机物含量较低而氮磷含量较高的特征[1-3]。由于碳源不足，采用生物法进行反硝化脱氮时效果较差，成为此类水处理的一大难点，因而针对性地开发低C/N废水脱氮处理技术势在必行。

本研究从C/N在3.4以下的低C/N废水中分离出3株可富集培养、脱氮产电效率高的菌种，考察了菌种的生理特性、脱氮效率及其用于反硝化MFC的可行性。开发能够在低C/N条件下高效脱氮的反硝化MFC，实现脱除污染物的同时产生能源，可为高氮低有机物废水处理提供参考数据。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

模拟废水：KH2PO422 mg/L(折合TP 5 mg/L)，MgSO4·7H2O 10 mg/L，CaCl210 mg/L，NaCl 10 mg/L，KNO3180.5 mg/L(折合TN 25 mg/L)，CH3COONa 170.8 mg/L(折合总碳(TC)50 mg/L)，微量元素溶液 0.5 mL/L。

低碳源反硝化培养液：柠檬酸三钠 2.5 g/L，KNO3757.5 mg/L(折合TN 105 mg/L)，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，K2HPO41 g/L，pH 7.0～7.5。

低碳源反硝化固体培养基：乙酸钠1.4 g/L，KNO32 000 mg/L，MgSO4·7H2O 200 mg/L，KH2PO41 g/L，K2HPO41 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0～7.5。

实验中所用化学试剂均为分析纯。

1.2 反硝化细菌的筛选与反硝化性能测定

从某污水处理厂的新鲜活性污泥中分离筛选反硝化菌种，将活性污泥经梯度稀释后在低碳源反硝化固体培养基上划线分离，反复分离多次后挑选单一菌落富集培养，得到3株反硝化菌，分别编号为M1、M2、M3，对其16S rDNA序列进行测序，在Gene Bank数据库中进行序列同源性比较，通过MEGA软件进行多重序列比对分析，并以Neighbor-Joining法构建系统发育树。

利用低碳源反硝化培养液于37 ℃对M1、M2、M3菌株分别培养48 h，每12 h测定培养液中TN的含量，计算3种菌株的脱氮率。

1.3 反硝化MFC的运行

本实验采用双极室MFC构建反硝化MFC，反应室由有机玻璃制成，有效容积为200 mL，阴极和阳极选用碳毡电极，碳毡电极经活化处理，长度5 cm，宽度1 cm。反硝化MFC由纳滤质子交换膜中间分隔，外部连接10 Ω电阻。将模拟废水置入双极室MFC中，分别加入3种富集培养的反硝化菌株启动反硝化MFC以测试其性能。调节每种反硝化细菌浓度为105cfu/mL，维持温度在32 ℃[9]，每隔10 min测量电压，当电压下降到20 mV以下时更换模拟废水，此过程为一个周期，每周期约3 d，反复3个周期后若电压保持稳定，认为反硝化MFC启动成功。

待反硝化MFC启动成功后，提高模拟废水中KNO3使TN初始质量浓度约250 mg/L，相应调整CH3COONa浓度，使模拟废水C/N保持在2.0，利用1%(质量分数，下同)的NaOH调整pH到7.5，取5 mL浓度为105cfu/mL的菌液，8 000 r/min离心后去除上清液，将下层富集的菌体投入反硝化MFC中进行补充，其他条件保持不变，连续运行80 h，考察反应室内TN变化。由于反硝化MFC启动时存在一定电压，此时加入菌液会对MFC有所扰动，电压波动较大，因此将30 min后稍稳定的电压作为初始电压，开始时每10 min测定一次，待电压稳定后每16 h测定一次，评估3种菌株的产电性能。

1.4 反硝化MFC的影响因素

在pH为7.5时，提高模拟废水中KNO3使TN初始质量浓度为400 mg/L，调节CH3COONa投加量使C/N分别为5.0、2.0、1.0、0.5，其他物质浓度不变。将不同C/N水平的模拟废水分别注入反硝化MFC，取5 mL M1菌液(105cfu/mL)于8 000 r/min离心后弃去上清液，将下层的富集菌体投入反硝化MFC，在32 ℃下持续运行80 h，记录MFC维持稳定运行状态下的电压，并考察TN变化，以计算脱氮率。

1.3 指标判定 用MMSE量表评估患者术后认知功能，包含语言能力、回忆力、计算力、注意力、记忆力、定向力等方面，正常：27-30分，轻度障碍：21-26分，中度障碍：10-20分，重度障碍：＜10分。记录其麻醉前、手术开始时、术中0.5h、手术完成时，患者平均动脉压、心率，以及术后睁眼时间、拔管时间，并比较。

控制模拟废水中KNO3、CH3COONa投加量使TN初始质量浓度为400 mg/L、C/N为2.0，用1%的NaOH调节反应室内pH分别为7.5、8.5、9.0、9.5、10.5，其他物质浓度与模拟废水保持一致。取5 mL M1菌液(105cfu/mL)于8 000 r/min离心后弃去上清液，将下层的富集菌体投入反硝化MFC，在32 ℃下持续运行96 h，连续记录反应室内电压及TN变化，计算脱氮率。

2 结果与讨论

2.1 菌株鉴定

经测序并在Gene Bank数据库中比对，实验所得的3株好氧反硝化菌均属于假单胞菌属(Pseudomonas)。利用MEGA软件构建M1、M2、M3菌株的系统发育树(见图1)。从图1可以看出，M1、M3菌株更加接近，与二者亲缘关系最近的是PseudomonasM1、M3菌株属橄榄绿假单胞菌润滑亚种(Pseudomonasoleovoranssubsp. lubricantis)。其中M1菌株表现出该亚种的明显特征，即其在反硝化固体培养基中呈白色圆形菌落状，略带褐绿色，表面光滑、黏稠，在反硝化液体培养基里呈绿色；M3菌株未表现出该特征。该亚种曾用于纺织废水的毒性评价与生物修复[10]，在反硝化MFC中尚未见报道。M2菌株属门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)，在已有的研究中被证实属于异养硝化菌，其在反硝化固体培养基中菌落呈白色，圆形，表面光滑、黏稠，在反硝化液体培养基中呈乳白色。

图1 M1、M2、M3系统发育树Fig.1 Phylogenetic dendrogram of M1, M2 and M3

oleovoranssubsp. lubricantis strain RS1，其16S rDNA序列同源性为99.79%；而与M2菌株亲缘关系最近的则为Pseudomonasmendocinastrain DS04-T，两者16S rDNA序列同源性为99.51%。

2.2 菌株反硝化性能

3株反硝化菌在低碳源反硝化培养液中TN变化见图2。实验过程中，M1、M2、M3菌株48 h的脱氮率分别为81.27%、76.66%、82.89%，与前人报道菌株的脱氮性能相近。杨静丹等[11]研究表明一株异养硝化-好氧反硝化菌HY3-2对硝酸盐的去除率为88.11%；而苑宏英等[12]利用序批式反应器所构建的生物反硝化系统中，TN去除率最高为64.7%。相比而言，本研究中3株反硝化菌均具有较好的脱氮能力，需进一步考察其在反硝化MFC中的脱氮性能。

图2 3种菌株的反硝化性能Fig.2 Nitrogen removal efficiency of three strains

2.3 反硝化MFC运行效果

2.3.1 反硝化MFC脱氮性能

图3 反硝化MFC的脱氮性能Fig.3 Nitrogen removal efficiency of denitrification MFC

2.3.2 反硝化MFC产电性能

3种菌株构建的反硝化MFC在运行前180 min的电压变化见图4。可以看出，M1菌株构建的反硝化MFC起始电压在171.6 mV，前80 min内反硝化MFC的电压持续快速增长，80 min后电压仍保持平稳上升趋势，140 min时达到240 mV左右并趋于稳定，相比于另外两个反硝化MFC，M1菌株构建的反硝化MFC电压最高且最早达到稳定，这也证实M1菌株在脱氮和发电上均具优势。

图4 反硝化MFC的产电性能Fig.4 Electrogenesis capacity of denitrification MFC

M1菌株与M3菌株有较近亲源性，但从构建的反硝化MFC发电性能上看，M1菌株优于M3菌株，可能与M1菌株自身含有的色素有关。M1菌株中的细胞色素可以进行直接的电子转移，促进了细菌与电极之间的电子传递[16]。M2菌株起始电压较高，为189.1 mV，自身产电性能较强，电压在短暂的下降后呈现上升趋势，在前90 min时上升较为平缓，此后上升较快，M3菌株相对于M1、M2达到峰值所用的时间更长，但趋势较为稳定，一直呈上升趋势，可能因为M2、M3菌株对本实验条件的适应过程较长，当菌株适应后，电压上升速度明显加快。

对脱氮、产电性能均较好的M1菌株反硝化MFC进行全过程电压分析，结果见图5。80 h内，其起始电压为171.6 mV，3 h内电压快速上升后达到峰值242.0 mV并持续至16 h，随后电压下降，80 h后电压降至155 mV左右。后续研究均采用M1菌株构建的反硝化MFC进行影响因素分析。

图5 M1菌株反硝化MFC的电压变化Fig.5 Voltage variation of strain M1 denitrification MFC

2.4 影响因素分析

2.4.1 C/N的影响

根据实验结果，C/N为5.0、2.0、1.0、0.5时，反硝化MFC在80 h的脱氮率分别为90.38%、92.86%、90.79%、89.96%，可见反硝化MFC在低C/N废水中依然能保持较高的脱氮率，说明在低C/N水平下利用反硝化MFC脱氮具有较强的可行性。C/N为2.0时反硝化MFC电压最快达到平衡，电压最高值为331.0 mV，在此C/N下反硝化MFC系统的脱氮、产电性能都比较好。而C/N比为5.0时，虽然起始电压(223.4 mV)比C/N为2.0时(189.0 mV)高15.4%，但随着反应的进行，电压增速总体平缓，在运行约10 h开始低于C/N为2.0时的电压，电压最高值仅为272.2 mV，可能因为C/N过高时，较多的有机碳使产电菌繁殖加快，细菌之间存在竞争，氧化有机物产生的电子不能全部用于产生电流，而是被消耗用于自身新陈代谢。相比之下，C/N为2.0时，细菌数量相对较少，细菌之间竞争并不强，因此氧化有机物产生的电子可充分用于产电，电压更高。

但过低的C/N同样不利于反硝化菌产电。当C/N为1.0、0.5时，电压最高值显著下降，只有70 mV左右。这是因为碳源供应不足时，反硝化菌仅能维持自身新陈代谢，尽管对反硝化过程无明显影响，但能够用于产电的自由电子数量大大下降，因而产电受到显著抑制。

综上可知，反硝化MFC系统适宜的C/N为2.0，该数值较接近我国地表水中实际的C/N水平(2.59左右)[17]，因而具有较强的实际应用潜能。

2.4.2 pH的影响

不同pH下，反硝化MFC的脱氮、产电性能见图6。由图6(a)可见，pH为8.5、9.0、9.5时，反硝化MFC在96 h的TN分别为33.82、19.25、23.06 mg/L，脱氮率分别为91.55%、95.19%、94.24%，尤其是pH=9.0时，30 h时TN就降至50.35 mg/L，脱氮率达到了87.41%；而pH=7.5、10.5时，反硝化MFC脱氮能力相对较弱，96 h时TN分别降至46.22、41.54 mg/L，脱氮率仅为88.45%、89.62%。可以看出，pH为8.5～9.5时反硝化MFC的脱氮性能最佳。

图6 不同pH下反硝化MFC的脱氮、产电性能Fig.6 Nitrogen removal efficiency and electrogenesis capacity of denitrification MFC under different pH

图6(b)可见，不同pH下反硝化MFC的电压均在24 h内增长迅速，24 h后呈现不同程度的下降。在pH=9.5时，其最大电压为344.4 mV，而在pH为7.5、8.5、9.0、10.5时反硝化MFC最大电压分别为225.2、288.1、309.9、295.2 mV。在pH为8.5～9.5的弱碱性区间内，反硝化MFC的产电能力处于较高水平。该现象与前人研究报道基本一致，赵芷玲[18]发现pH在8～9时反硝化MFC的产电和脱氮性能较好，比pH为7时的硝酸盐降解率高108.5%。这可能是因为弱碱性条件消耗了一部分氢离子，使部分电子从脱氮或新陈代谢中脱离出来并能够用于产电。然而当pH过高时，不利于反硝化细菌的生长，反硝化细菌的酶活性降低，反硝化效率下降，产电能力降低。

3 结 论

(1) 好氧反硝化菌M1、M2、M3菌株均属假单胞菌属(Pseudomonas)，M1、M3菌株为橄榄绿假单胞菌润滑亚种(Pseudomonasoleovoranssubsp. lubricantis)；M2菌株为门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)。在低碳源反硝化培养液中培养M1、M2、M3菌株，48 h的脱氮率分别为81.27%、76.66%、82.89%。

(2) 以菌株M1、M2、M3构建的反硝化MFC在80 h时对TN为250 mg/L模拟废水的脱氮率分别为93.75%、88.94%、91.36%。其中M1菌株构建的反硝化MFC电压最高且最早达到稳定。可见M1菌株反硝化MFC在脱氮和产电上均具优势。反硝化MFC系统适宜的C/N为2.0，最适pH为8.5～9.5。