湖南地区4132例备孕女性遗传性耳聋基因筛查结果分析

葛虎 余艳 周梅华 杨瑶 汪静 张家美 何媛 龚强

长沙金域医学检验实验室(长沙410000)

听力障碍是人类中最常见的神经感觉障碍疾病，在新生儿中发生率为1‰～ 3‰，其中由遗传性因素导致的比例约占60%，包括综合征和非综合征形式，具有高度的遗传异质性[1-3]。目前，与耳聋相关的致病基因已超过300种被报道[4]，分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X染色体隐性遗传和母系遗传四种遗传方式[3]。针对备孕妇女进行高携带率基因突变位点筛查可有效降低新生儿耳聋发生率。本研究针对湖南地区4132例备孕妇女血液样本，18个耳聋致病基因的108个位点进行筛查，统计分析耳聋相关致病基因的突变位点、突变类型及突变频率等特点，为湖南地区进行耳聋致病基因突变位点筛查提供有效依据。

1 对象与方法

1.1 对象

2018年12月至2019年11月，长沙金域医学检验所有限公司检测的来源于湖南省各地备孕女性(18-40岁)的4132例血液样本。本研究获得长沙金域伦理委员会批准，进行基因检测前，筛查者均被详细讲解耳聋基因筛查的相关知识。

1.2 研究方法

1.2.1 试剂与仪器

核酸提取或纯化试剂盒、遗传性耳聋基因检测试剂盒和测序反应通用试剂盒(芯片)(博奥木华基因)，无核酸酶水和NaOH(Sigma)，异丙醇和无水乙醇(分析纯、湖南汇虹试剂有限公司)，Qubit®dsDNA HS Assay Kit(invitrogen)。生物安全柜(BioBase)，荧光定量仪(Qubit®3.0 Fluorometer)，恒温混匀仪(Themo‐mixer c)，移液枪和高速离心机(Eppendorf)，PCR 仪(ABI Veriti)，基因分析仪(BES4000基因分析仪)。

1.2.2 DNA提取

参照核酸提取或纯化试剂盒说明书提取样本DNA，保存于-20℃冰箱中备用。

1.2.3 文库构建与上机测序

参照遗传性耳聋基因检测试剂盒说明书配制扩增体系并加入DNA样本。扩增程序如下：95℃3min；95℃ 15s，60℃ 90s，72℃ 1min，循环 35 次；72℃1min，16℃∞。然后对PCR产物离心30s，利用特定磁珠对PCR产物进行纯化和分选，通过Qubit进行定量。并按照一定比例混合文库，参照测序反应通用试剂盒(芯片)检测试剂盒说明书对文库进行上机测序步骤。

1.2.4 结果处理与统计分析

通过博奥木华所开发的在线数据处理系统对测序原始数据进行处理。并针对单基因突变型样本 200例的SLC26A4、GJB2、GJB3、MT-CO1、MTRNR1以及MT-TL1基因进行突变位点统计分析。

2 结果

对湖南地区4132例备孕女性样本的18个耳聋基因的108个位点的筛查结果进行统计分析，发现202例含有位点突变，阳性率为4.89%(202/4132)。在检测的18个基因中，携带突变位点的基因有SLC26A4、GJB2、GJB3以及线粒体基因(MT-CO1,MT-RNR1,MT-TL1)，其中SLC26A4(1.69%,70/4132)和GJB2(2.08%,86/4132)基因在备孕女性中的携带率明显高于其他基因，在阳性样本中分别占34.65%(70/202)和42.57%(86/202)。GJB3基因的阳性率为0.29%(12/4132)，占阳性样本总数的5.94%(12/202)。另外，发现线粒体基因突变32例，占0.77%(32/4132)。其中MT-CO1和MT-RNR1为主要的线粒体突变基因，阳性率分别为0.34%(14/4132)和0.41%(17/4132)，占阳性样本总数的6.93%(14/202)和8.42%(17/202)。此外，两种多基因突变型SLC26A4/MT-RNR1和GJB2/GJB3各1例。详见表1。

表1 4132例备孕女性样本中各突变基因的统计结果Table 1 The statistical results of mutant genes in 4132 preg‐nant women samples

数据显示：200例单基因突变型样本中，SLC26A4基因突变占35.00%(70/200)，包括19种突变位点(表2)，以及1例复合杂合突变(c.1229C>T/c.1975G>C)（本人听力正常。小孩已出生3个月，听力筛查通过）。其中，IVS7-2A>G位点携带频率最高，占SLC26A4基因突变的44.29%(31/70)。86例GJB2基因携带7种突变位点(表2)，c.235delC突变69例，占GJB2基因突变的80.23%(69/86)，占单基因突变样本数的34.50%(69/200)。GJB3基因突变样本12例，包括1例c.423delATT、7例c.538C>T以及4例c.547G>A。另外，统计结果显示线粒体基因突变32例，包括14例m.7444G>A(MT-CO1)，17例m.1555A>G(MT-RNR1)以及1例m.3243A>G(MTTL1)。其中，均质突变为线粒体基因主要携带方式，占90.63%(29/32)。详见表2。

表2 200例单基因突变型样本中各突变位点的统计结果Table 2 The statistical results of mutation sites in 200 single-gene mutation samples

3 讨论

本研究针对18个耳聋基因(GJB2、SLC26A4、GJB3、MYO15A、TECTA、DIABLO、COCH、DSPP、GPR98、DFNA5、TMC1、MT-CO1、MT-RNR1、MTTH、MT-TS1、MT-TL1、PRPS1、MYO7A)进行筛查，发现在湖南地区发生的主要突变基因为SLC26A4、GJB2、GJB3和MT-RNR1，与文献[5-14]报道一致。在4132例样本中，通过108个位点筛查到202例阳性样本，阳性率为4.89%(表1)，高于石亮程等人[9]对长沙地区1951例孕妇进行耳聋基因9位点筛查的阳性率(4.00%)，以及李春成等人[10]对湘潭地区1610例孕妇进行耳聋基因9位点筛查的检出率(4.29%)。结果表明本研究的检测范围更大，具有更高的检出率，能够有效地降低假阴性。

通过对耳聋基因108个位点筛查发现本地区携带率较高的突变位点为SLC26A4：c.697G>C、c.1229C>T、c.2000T>C、c.2162C>T、c.2168C>T、IVS16-6G>A、IVS7-2A>G ；GJB2：c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT；GJB3：c.538C>T、c.547G>A；MT-CO1：m.7444G>A；MT-RNR1：m.1555A>G。以及已被文献[15-23]证明与耳聋相关，携带率较低的突变位点：MT-TL1(m.3243A>G)、GJB2(c.512in‐sAACG,c.427C>T,c.416G>A,c.257C>G)、GJB3(c.423delATT)、SLC26A4(c.269C>T,c.349delC,c.387delC,c.439A>G,c.589G>A,c.754T>C,c.1336C>T,c.1343C>T,c.1975G>C,c.2027T>A,c.2086C>T,IVS15+5G>A)(表2)。另外，本研究在4132位备孕女性中并未发现m.12201T>C突变位点，而李春成等人[10]的耳聋基因9位点研究在湘潭地区发现了一例m.12201T>C突变。因此，本研究认为湖南地区在耳聋基因筛查的基因位点中需要包含以上位点，以避免备孕女性在筛查过程中被漏检，从而降低新生儿的耳聋发生率。

另外，在针对孕妇的耳聋相关基因位点筛查的研究中[5-12]，均包含以下7种突变位点：c.235delC、c.299_300delAT、c.176_191del16、c.538C>T、c.2168A>G、IVS7-2A>G、m.1555A>G。同样，以上7种突变位点在本研究中的总阳性率为3.44%。说明以上7种突变位点在各地区普遍存在，是我国常见的耳聋基因突变位点。除以上7种常见突变位点以外，本研究的其他突变位点的检出率为1.45%。主要的原因是本研究涵盖了大量的不常见的致病突变位点，表明仅关注与耳聋相关的常见突变位点不足以有效降低耳聋的发生风险。由此可见，根据本地区耳聋基因位点的突变情况，扩大筛查范围，可以降低受检者的假阴性率。综上所述，在湖南地区，耳聋相关基因筛查范围必须包含常见的7种突变基因位点，同时也需增加该地区所含有的一些罕见突变位点。