犬瘟热、犬细小病毒疫苗株与国内流行毒株的同源性分析

李双男 ， 张贺楠 ， 何至远 ， 王振豹 ， 郝霖雨 ， 张钊伟 ， 王洪海 ， 牛建祁

(中牧实业股份有限公司 ， 北京 丰台 100070)

犬四联弱毒活疫苗可以预防犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬副流感、犬腺病毒(犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎)感染症。

犬瘟热 (Canine distemper，CD) 是由犬瘟热病毒 (Canine distemper virus，CDV) 引起的一种以鼬科、犬科、海豹科、部分浣熊科等为主的食肉动物急性、烈性、高度接触性传染病[1-2]。犬瘟热患病动物的康复依赖于机体的抗体水平，对于犬瘟热的治疗目前无特效药物，最有效的预防方法仍是接种疫苗。血凝蛋白(H)是CDV囊膜表面主要糖蛋白之一，CDV通过H蛋白吸附到细胞受体上来启动病毒感染过程，因此H蛋白决定了CDV的宿主特异性和组织嗜性。犬细小病毒病(Canine parvovirus disease,CPD)又称犬传染性肠炎或犬病毒性肠炎，是由犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的犬的一种急性、接触性、致死性传染病。CPV属于细小病毒科细小病毒属，衣壳蛋白VP2在确定CPV的抗原性和宿主范围方面起着重要作用[3-4]。

本试验以PCR的方法对犬瘟热病毒H基因、犬细小病毒VP2基因进行序列扩增，利用生物软件参照国内流行毒株序列，对A厂和B厂疫苗毒株序列进行分析，比较疫苗毒株间差异及疫苗毒与流行毒之间差异。

1 材料与方法

1.1 材料 A厂家：犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒与犬细小病毒病四联活疫苗，批号：1901001；B厂家：犬瘟热、腺病毒2型、副流感、细小病毒病四联活疫苗，批号：320966B；DNA 提取试剂盒、RT-PCR试剂盒，均购自北京全式金生物技术有限公司；引物由北京新时代(三博远志)科技有限公司合成。

1.2 引物设计 根据GenBank上已发表的犬瘟热病毒H基因、犬细小病毒VP2基因序列设计2对引物：P1:CDV-H-F 5′-ATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTG-3′；P2:CDV-H-R 5′-GTCAGGGATTTGAACGGTTACATG-3′；P3:CPV-VP2-F 5′-TACAGGATCTGGGAACGGGT-3′；P4:CPV-VP2-R 5′-TGGATTCCAAGTATGGGAGGC-3′，预测CDV和CPV的PCR产物大小为1.7 bp。

1.3 基因组的提取及PCR/RT-PCR的检测 取A厂和B厂的疫苗稀释液200 μL，用DNA/RNA提取试剂盒提取DNA/RNA样本。分别用P1和P2扩增CDV基因片段，P3和P4扩增CPV基因片段，PCR反应体系：模板 DNA 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Rmix 25 μL，Emix 1 μL,ddH2O 12 μL。CDV反应条件:45 ℃反转录30 min，94 ℃预变性5 min； 94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 100 s,共35个循环；72 ℃延伸10 min。CPV同上述反应条件，无需反转录过程。PCR产物于4 ℃保存，取5 μL进行凝胶电泳。

1.4 各疫苗毒株的序列测定与分析 PCR产物送北京新时代(三博远志)科技有限公司进行序列测定，从NCBI的数据库中检索已发表的我国CDV与CPV流行毒株的序列，并下载保存，将2个厂家测序结果与我国流行毒株利用MEGA 6和Megnalign软件进行序列分析比对，绘制进化树，分析同源性，并对主要蛋白的突变点进行差异分析。

2 结果

2.1 各基因序列的PCR扩增 提取基因组经PCR/RT-PCR 扩增，测序表明，获得CDV的PCR产物大小为1 763 bp，CPV的PCR产物大小为1 754 bp，结果与预期大小一致(图1)。

图1 不同厂家疫苗毒CDV的H基因与CPV的VP2基因PCR扩增Fig.1 PCR amplification of the H gene of CDV and VP2 gene of CPV from different vaccine manufacturersM：DL 2 000 plus marker； 1： A厂疫苗CDV的PCR产物; 2： B厂疫苗CDV的PCR产物; 3: A厂疫苗CPV的PCR产物; 4: B厂疫苗CPV的PCR产物M: DL 2000 plus marker; 1: PCR product of CDV vaccine from manufacturer A; 2: PCR product of CDV vaccine from manufacturer B; 3: PCR product of CPV vaccine from manufacturer A; 4: PCR product of CPV vaccine from manufacturer B

2.2 CDV疫苗H基因序列分析 A厂家和B厂家2个厂家疫苗提取的CDV疫苗毒H基因和我国已发表的部分毒株序列构建分子进化树与核苷酸序列同源性结果见图2。2个厂家CDV疫苗毒株核苷酸序列同源性为92.9%，与国内流行毒株核苷酸序列同源性均在89.6%以上，相似性高，其中B厂家的CDV毒株与国内流行毒株的核苷酸序列同源性在92.5%～95.6%，A厂家的CDV毒株与国内流行毒株的核苷酸序列同源性在89.6%～96.2%。

图2 CDV疫苗毒H基因分子进化树与核苷酸序列同源性分析Fig.2 Molecular evolution tree and nucleotide sequence homology analysis of H gene of CDV vaccine virus

2.3 CPV疫苗VP2基因序列分析 A厂家和B厂家2个厂家疫苗的CPV疫苗毒VP2基因和我国已发表的部分毒株序列构建分子进化树与核苷酸序列同源性比较结果见图3。2个厂家CPV疫苗毒株核苷酸序列同源性为98.6%，与国内流行毒株核苷酸序列同源性均在98.1%以上，相似性高，其中B厂家的CPV毒株与国内流行毒株的核苷酸序列同源性在98.7%～99.5%，A厂家的CPV毒株与国内流行毒株的核苷酸序列同源性在98.1%～98.6%。

图3 CPV疫苗毒VP2基因分子进化树与核苷酸序列同源性分析Fig.3 Molecular evolution tree and nucleotide sequence homology analysis of VP2 gene of CPV vaccine virus

2.4 CDV与CPV疫苗毒重要结合位点差异分析 CDV H蛋白作为重要的膜蛋白，主要通过与宿主体内信号淋巴细胞激活因子(SLAM受体)的结合进行复制。研究表明，H蛋白个别氨基酸位点改变会影响与SLAM受体的结合能力。文献报道这些位点集中在第525、526、529、530位和第549位等位点。分析发现，A厂家的疫苗株的这几个位点氨基酸与国内流行毒株在第530位和第549位氨基酸差异明显。B厂家的疫苗株的这几个位点氨基酸与国内流行毒株在第530位氨基酸差异明显。

CPV的VP2基因长1 755 bp，编码584个氨基酸，在MegAlign软件中将由本试验扩增得到的疫苗毒株VP2基因的氨基酸推导序列进行差异比较后，与GenBank中我国境内分离到的流行毒株进行氨基酸比对分析，共发现了5个主要位点的差异，分别是第44、219、375、386位和第418位氨基酸。见表1。

表1 CDV与CPV疫苗毒重要结合位点差异分析Table 1 Difference analysis of important binding sites of CDV and CPV vaccine virus

3 讨论

同源性是指在进化过程中源于同一祖先的分支之间的关系，疫苗毒株与流行毒株的同源性越高，从某种程度上来讲越能提供更高的保护力。本试验通过比较不同厂家疫苗毒株序列与国内流行毒株的序列的差异，对其同源性进行分析，A厂和B厂生产的犬四联活疫苗比较，两者犬瘟热、犬细小毒株序列同源性均较高，分别为CDV 92.9%和CPV 98.6%，但B厂家的CDV和CPV毒株序列与国内已发表的流行毒株相比同源性略高于A厂家。毒株关键蛋白的几个关键位点碱基、氨基酸的变化就会影响病毒的生物学特征，决定病毒抗原特性及宿主范围的改变。而本试验针对的CDV的H蛋白和CPV的VP2蛋白正是起决定作用的关键蛋白。CDV的H蛋白个别氨基酸位点改变会影响与SLAM受体的结合能力，从而影响免疫机制的工作，本试验选取的A厂家和B厂家2个厂家在H蛋白的关键位点氨基酸均有不同程度的变化，理论上来说，免疫效果也有略微差异，而宿主的免疫机制以及身体因素也是免疫效果的重要方面。

据文献报道，CPV的变异主要存在于第323、426、440位。第323位氨基酸可以影响病毒与转铁蛋白受体的结合[5]；第426位决定CPV的突变株类型，CPV-2a为天冬酰胺(N)，CPV-2b为天冬氨酸(D)。2000年，CPV-2c的出现则是VP2基因上第426位氨基酸转变为谷氨酸(E)。这种新的变异株在美国、意大利、巴西、印度等地都有出现过。第440位氨基酸位于GH LOOP区，相关报道指出，第440位氨基酸(Thr→Ala)的高突变与抗原的不断变异有关，进一步表明该位点具有高突变性[6]。而本试验的2个 厂家的疫苗在几个主要变异位点上均一致，可以推测，在细小病毒的防控方面2个厂家差异不大。目前CPV在全球的防控仍较严峻，有文献报道免疫过细小病毒疫苗的犬仍有患病的风险[7-8]。

犬四联疫苗的选择需要考虑以下几个因素:毒株匹配度、抗原含量、佐剂等。综合分析，想要给予饲养犬只更好的保护，接种疫苗无疑是最好的选择，但疫苗产品与厂家的选择要从多方面来综合考虑，不能单凭一个方面来下结论。