加味茵陈蒿口服液制备工艺研究

吕一舟，范云鹏*，张艳玲，马 霞,*，郭振环，刘永录，张国祖

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.河南牧业经济学院，河南郑州 450046；3.河南省康星药业股份有限公司，河南郑州 451464)

鸭病毒性肝炎多发于雏鸭，是由鸭肝炎病毒感染引起的，发病后肝脏损伤严重并且病死率极高，在没有特效抗病毒药物治疗下严重影响鸭场的经济效益[1]。为了促进鸭养殖场稳定发展，减少鸭场病毒性肝炎疾病的发生，从中兽医学角度辨证，该病属于湿热之毒内侵导致肝脾不调、下注于肾，选方应以清热解毒，疏肝利胆为原则[2]。有研究表明，茵陈蒿汤具有抗肝损伤、防治脂肪肝、抗肝纤维化等作用[3-5]，临床常用于急性病毒性肝炎[6]、黄疸性肝炎和肝内胆汁淤积[7-10]等证属湿热内蕴者，在肝病治疗领域有着广阔的应用前景。本试验结合水禽生理特点，在茵陈蒿汤基础上进行加味，即茵陈120 g，栀子60 g，大黄45 g，甘草25 g。为了确定科学合理的制备工艺条件，本试验进行了水提、醇提、水提醇沉3种提取工艺，以浸膏得率和栀子苷含量为指标，并结合实际生产、考虑成本等确定最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材与试剂 茵陈、栀子、大黄、甘草，郑州瑞龙制药股份有限公司产品；栀子苷对照品，成都曼斯特生物科技有限公司产品；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司产品；纯净水，娃哈哈股份有限公司产品。

1.1.2 主要仪器 高效液相色谱仪(Agilent Technologies 1260)，安捷伦科技(中国)有限公司产品；超声波清洗器(SYU-3-100D)，郑州生元仪器有限公司产品；电子天平(BSA224S)，赛多利斯科学仪器有限公司产品；数显恒温水浴锅(HH-2)，上海力辰邦西仪器科技有限公司产品；数显智能控温磁力搅拌器(SZCL-2)，郑州科达机械仪器设备有限公司产品；循环水真空泵(SHZ-D)，郑州科达机械仪器设备有限公司产品；低温冷却液循环泵(DLSB-5/10)，郑州科达机械仪器设备有限公司产品；旋转蒸发器(RE-5299)，郑州科达机械仪器设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 水提制备工艺研究

1.2.1.1 吸水率考察 称取茵陈30 g、栀子15 g、大黄11.25 g、甘草6.25 g，重复3份。加10倍量水浸泡，直至药材全部浸透为止，滤出未被吸收的水液，称量吸水后药材的重量，计算吸水率[11]。

1.2.1.2 水提工艺的正交设计试验 称取茵陈30 g、栀子15 g、大黄11.25 g、甘草6.25 g，共9份，按照表1中三因素三水平正交设计试验进行煎煮，过滤，合并滤液后，常压浓缩至最小体积，转移至蒸发皿内干燥至恒重，制得浸膏，并计算浸膏得率(公式下同)。

浸膏得率

1.2.2 醇提工艺的正交设计试验 称取茵陈20 g、栀子10 g、大黄7.5 g、甘草4.17 g，共9份，粗粉碎后按照表2中四因素三水平正交设计试验进行加热回流，过滤，合并滤液后，减压浓缩至小体积，转移至蒸发皿内干燥至恒重，制得浸膏，并计算浸膏得率。

表2 醇提工艺的正交设计试验

1.2.3 水提醇沉工艺的单因素试验

1.2.3.1醇沉终浓度筛选 取1.2.1中最佳条件的加味茵陈蒿口服液水提液4份进行醇沉，边加边搅拌，至乙醇浓度为800、750、700、600 mL/L，置4℃冰箱过夜，48 h后取出，去沉淀取上清，回收乙醇，减压浓缩至小体积，转移至蒸发皿内干燥至恒重，制得浸膏，并计算浸膏得率。

1.2.3.2 醇沉时间的考察 取1.2.1中最佳条件的加味茵陈蒿口服液水提液4份进行醇沉，边加边搅拌，至乙醇浓度为750 mL/L，放置4℃冰箱过夜，12、24、36、48 h后取出，去沉淀取上清，回收乙醇，减压浓缩至小体积，转移至蒸发皿内干燥至恒重，制得浸膏，并计算浸膏得率。

1.2.4 加味茵陈蒿口服液中栀子苷含量测定

1.2.4.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-1 mL/L磷酸水 (15∶85)为流动相，检测波长为 238 nm，流速为1 mL/min，对照品和供试品进样量10 μL。

1.2.4.2 栀子苷对照品配制 取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.3 mg的溶液，滤膜过滤即得。

1.2.4.3 供试品溶液及阴性对照溶液配制 精密称取上述水提、醇提、水提醇沉工艺制备的浸膏各0.040 g，置于10 mL容量瓶中，加甲醇10 mL，超声30 min，放冷，定容后摇匀，用有机滤膜过滤，即得。另取缺栀子的阴性对照浸膏同法制成阴性对照溶液。

2 结果

2.1 水提制备工艺研究

2.1.1 吸水率考察 由表3数据分析可知，称取加味茵陈蒿口服液处方药的1/4重量加水浸泡后，其吸水率为187%～200%，约为2倍吸水量。

表3 水提工艺的吸水率考察

2.1.2 栀子苷专属性考察 由图1可看出，栀子苷专属性好，阴性样品无干扰。

A.栀子苷标准品；B.供试品处理；C.阴性对照处理A.Geniposide standard；B.Testing sample；C.Negative control

2.1.3 水提工艺正交试验安排与结果 由表4极差分析结果可知，水提工艺各因素水平对浸膏得率影响依次是C>A>B，即煎煮次数>料液比>提取时间，浸膏得率最佳的工艺为A3B1C3。影响栀子苷含量因素水平顺序为C>B>A，即煎煮次数>提取时间>料液比，提取栀子苷含量最高的工艺为A1B3C3，其次是A3B1C3。

表4 水提工艺正交试验安排与结果

通过表5方差分析得出，提取次数对浸膏得率和栀子苷含量存在极显著性差异(P<0.01)，其他因素影响小。考虑到生产中水分挥发快，故确定料液比为1∶12；经数据统计分析得出提取时间对浸膏得率和栀子苷含量影响小，从缩短生产周期和提高经济效益考虑，选取煎煮时间为1 h；煎煮2次与煎煮3次对浸膏得率和栀子苷含量的显著性差异不明显(P>0.05)，为降低生产成本选择煎煮次数为2次。因此确定的最佳水提工艺条件为：A3B1C2，即补足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡30 min，每次煎煮1 h，煎煮2次。

表5 水提工艺试验方差分析

2.2 醇提工艺正交试验安排与结果

由表6极差分析显示，影响醇提工艺浸膏得率的水平顺序是D>C>A>B，即提取次数>提取时间>乙醇浓度>料液比，浸膏得率最佳组合为A2B1C2D3；影响栀子苷含量因素水平顺序为A>D>B>C，即乙醇浓度>提取次数>料液比>提取时间，提取栀子苷含量最高为A3B2C1D3。

表6 醇提正交试验安排与结果

通过表7方差分析可看出提取次数对浸膏得率影响存在极显著差异(P<0.01)。由数据分析可知，提取2次和提取3次对浸膏得率差异不显著(P>0.05)，料液比和提取时间对浸膏得率和栀子苷含量影响小，700 mL/L乙醇浓度和800 mL/L乙醇浓度对栀子苷含量影响差异不显著(P>0.05)，考虑成本和时间问题，确定醇提最佳工艺为：A2B1C1D2，即加8倍量700 mL/L乙醇，加热回流2次，每次40 min。

表7 醇提工艺试验方差分析

2.3 水提醇沉工艺的单因素试验结果

通过最佳水提工艺补足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡半小时，煎煮2次，每次煎煮1 h。合并两次滤液浓缩，使药液浓度为含生药1 g/mL，放冷后进行醇沉工艺单因素试验。由图2A可看出醇沉终浓度在700 mL/L时浸膏得率和栀子苷含量最高；图2B显示醇沉时间在48 h时栀子苷含量和浸膏得率最高，因此确定醇沉最佳工艺为700 mL/L醇沉终浓度，醇沉48 h。

A.醇沉终浓度单因素试验；B.醇沉时间单因素试验A.Single factor test of final concentration of alcohol precipitation; B.Single factor test of alcohol precipitation time

3 讨论

中兽医理论认为，鸭病毒性肝炎是雏鸭受病毒、湿邪侵扰，脾阳困而运化失，肝风内动，导致病鸭食欲废绝、排稀粪，严重者出现昏迷倒地、角弓反张等症状[2]。本方剂以茵陈为主药，清湿热，利肝胆；栀子清泄三焦湿热；大黄荡涤肠胃淤热；添加甘草进行加味，甘草补脾益气，清热解毒，缓急止痛，有调和诸药之功效[12-14]。前三药均味苦性寒，清热利湿，使湿从二便排泄，而甘草味甘，性平，可调和苦寒之性，调节口味，制成口服液便于临床使用。

中药口服液的制备工艺会直接影响其有效成分的含量及后期的临床使用效果，现代制药工艺的发展使很多质控指标得到改进[15]。茵陈作为加味茵陈蒿口服液中的君药，其有效标识成分是绿原酸。在前期摸索试验中发现去除茵陈的阴性对照里也检出绿原酸，且含量不低，这与杨海玲等[16]研究的不同炮制方法对栀子中绿原酸含量影响相符合，栀子中也含有绿原酸。由于茵陈中的绿原酸在本方剂中不具备专属性，故选取专属性好的栀子苷作为衡量指标之一。

水提醇沉单因素试验不同浓度及不同醇沉时间的药液在回收乙醇至无醇味补足水量后，4℃放置24 h后都出现了沉淀，且摇之不易散，放置室温和加热至40℃以上也不消散，由此可看出加味茵陈蒿口服液水提醇沉工艺不稳定，故排除此种工艺在生产中的应用。 影响加味茵陈蒿口服液水提工艺和醇提工艺的首要因素为煎煮(提取)次数，水提工艺中煎煮2次的浸膏得率范围在12.3%～18.3%，栀子苷含量在10.51 mg/g～13.96 mg/g之间。醇提工艺中提取2次的浸膏得率范围在12.7%～14.5%，栀子苷含量在10.74 mg/g～25.88 mg/g之间。从经济成本考虑，按照水提最佳工艺：补足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡30 min，每次煎煮1 h，煎煮2次的方法提取500 g药材，所需的用水量为13 L，按照商业用水价格计算约为1元，能耗价格约为3元，总成本为4元。按照醇提最佳工艺：8倍量700 mL/L乙醇，加热回流2次，每次40 min的方法提取500 g药材，所需的无水乙醇量为5.6 L，水量为2.4 L，价格约为56.2元，能耗价格约为5元，总成本在61.2元左右。

结果可见，水提浸膏得率12.3%～18.3%与醇提浸膏得率12.7%～14.5%差别不大。而醇提时栀子苷含量虽然最高为25.88 mg/g，但此时乙醇浓度是800 mL/L，经济成本换算后，以水提工艺最节约易行。

通过以上试验研究并结合成本、工时等因素考虑，确定了加味茵陈蒿口服液的最佳制备工艺为水提工艺，即补足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡30 min，每次煎煮1 h，煎煮2次。具有成本低、提取效率高、安全方便、操作简单等优点，适合大规模的生产和应用。