生物被膜形成对猪源沙门氏菌耐药性和毒力的影响

唐正露，陈传荣，姚 明，罗聪玉，张 丽，李 郁

(安徽农业大学，安徽合肥 230036)

沙门氏菌(Salmonella)为一种属于肠杆菌科的革兰氏阴性杆菌，存在于温血动物或冷血动物的肠道内，几乎具备了一切使其广泛分布所需要的特性，包括广泛的动物与人宿主、带菌动物与人的粪便排泄物、对自然环境的抵抗力及有效利用传播介质(食品、饲料、污染物、运输工具等)，很容易造成在动物与动物、动物与人之间的传播。如猪的沙门氏菌感染，一是能引起临床疾病，包括急性败血症和慢性胃肠炎等，二是可成为许多猪肉产品的污染源，威胁人类健康。故沙门氏菌不仅是一种重要的人畜共患病原菌，也是众多国家引起食源性疾病的首要病原，在医学、兽医学和公共卫生方面均具有重要意义。

细菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)是细菌群体被自身胞外多聚物包裹，不可逆地附着于接触表面而形成的有组织的膜状物质，这是细菌为适应自然环境有利于生存的一种生命现象。细菌对抗生素的耐药性目前已成为全球的医学、兽医学及社会关注的问题，而BF是细菌耐药性产生的一个重要方面。研究表明几乎所有的细菌在一定条件下都可以形成BF[1]。BF一旦形成，就会对抗生素的杀菌作用和宿主免疫清除作用的抵抗力增强。此外，BF作为细菌的毒力因子，可参与细菌侵袭宿主的过程，在细菌致病中发挥作用。近年来，有关BF与抗生素及致病性的研究多见于葡萄球菌、链球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和变形杆菌等，针对沙门氏菌的则较为少见。

为了解BF形成对沙门氏菌的耐药性及毒力的影响，本研究采用96孔微量板法、纸片琼脂扩散法(K-B法)、微量稀释法和寇氏改良法，对来源自腹泻仔猪的69株沙门氏菌分离株进行成膜能力、23种抗菌药物敏感性、最小抑菌浓度(MIC)及对小鼠半数致死量(LD50)的测定，旨在为防治沙门氏菌感染或沙门氏菌病提供临床参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 69株分离自腹泻病仔猪的沙门氏菌，安徽农业大学动物传染病研究室分离、鉴定和保存(信息见表1)。质控菌株大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923，中国药品生物制品检定所产品。

表1 69株受试沙门氏菌分离株信息

1.1.2 实验动物 120只体重为18 g～22 g清洁级雌性昆明小鼠，安徽医科大学实验动物中心提供。

1.1.3 药敏纸片 氨苄西林(AMP)、阿莫西林(AMX)、四环素(TET)、强力霉素(DOX)、头孢曲松(CRO)、头孢哌酮(CFP)、庆大霉素(GM)、阿米卡星(AN)、甲氧苄啶(TMP)、复方新诺明(SXT)、诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、呋喃妥因(FT)、氟苯尼考(FFC)、左氧氟沙星(LVX)、妥布霉素(TM)、加替沙星(GAT)、氨苄西林-舒巴坦(SAM)、氨曲南(AZT)、头孢吡肟(FEP)、哌拉西林-他唑巴坦(TZP)、亚胺培南(IPM)、头孢拉定(RAD)药敏纸片，杭州微生物试剂有限公司产品。

1.1.4 主要培养基和试剂 水解酪蛋白琼脂(MHA)、水解酪蛋白肉汤(MHB)、牛肉膏(Beef Extract)、蛋白胨(Peptone)、琼脂粉(Agar powder)、缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿增菌液 (TTB)、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、亚硫酸铋琼脂(BS)、木糖赖氨酸脱氧胆盐 (XLD)、肠道菌增菌肉汤(EE)、伊红美蓝琼脂(EMB)、三塘铁琼脂(TSI)、胰酪 胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB)、V-P试剂、Kovac试剂、枸橼酸盐生化管，杭州微生物试剂有限公司产品。

1.1.5 主要仪器设备 高速冷冻离心机，珠海黑马医学仪器有限公司产品；恒温振荡培养箱，上海福玛实验设备有限公司产品；酶标仪，TECAN公司产品；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 沙门氏菌成膜能力测定 采用96孔微量板法[2]。将69株受试沙门氏菌分别接种至LB培养基37℃过夜培养，按1∶100稀释至LB培养基中，吸取200 μL稀释菌液接种于96孔细胞培养板，37℃静置培养36 h，弃上清液，加甲醇固定20 min后倒掉，PBS洗涤3次，加10 g/L结晶紫200 μL/孔进行染色，5 min后自来水冲洗并拍干，330 mL/L冰醋酸作用0.5 h，测定OD570 nm值。成膜能力判定标准[3]：以阴性对照OD570 nm平均值加其3倍标准差SD定义为ODc，将待测菌株OD与ODc比较，若OD4ODc，强阳性(3+)。

1.2.2 沙门氏菌体外成膜生长曲线测定 选择成膜能力不同的8株沙门氏菌，编号分别为2、45、47(3+)，23、57、68(1+)，55、66(-)，依照1.2.1分别测定其在6、12、24、36、48、60、72 h的OD570 nm值。以时间为横坐标，OD570 nm值为纵坐标，绘制体外成膜生长曲线。每株菌重复测定2次。

1.2.3 沙门氏菌药敏试验 采用纸片琼脂扩散法(KB法)测定69株沙门氏菌对23种抗菌药物的感受性。根据美国临床实验室标准委员会(CLSI/NCCLS)2015版执行标准判定结果。

1.2.4 沙门氏菌成膜菌与浮游菌最小抑菌浓度(MIC)测定 选择3株成膜能力强阳性(3+)沙门氏菌，编号为2、45、47，参考文献[4]方法制备成膜菌和浮游菌，采用微量稀释法测定两者的MIC。

1.2.5 沙门氏菌成膜菌在不同时间点的MIC测定 按照1.2.4分别测定编号为2、45、47沙门氏菌在成膜6、12、24、36、48、60、72 h时的MIC。

1.2.6 沙门氏菌半数致死量(LD50)测定 采用平板计数法分别测定1.5中的8株沙门氏菌在0、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h时的活菌数(CFU/mL)，每株菌重复2次，绘制生长曲线，选择对数生长末期与稳定期之间细菌，采用寇氏改良法进行小鼠攻毒试验，测定LD50。

1.2.7 数据处理分析 试验数据用Excel进行初步处理，再用SAS 9.0软件进行方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较；以P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 沙门氏菌成膜能力测定结果

在69株受试沙门氏菌中有64株形成生物膜(成膜菌)，成膜阳性率为92.8%。其中成膜能力强阳性(3+)10株，占比15.6%；中等阳性(2+)0株；弱阳性(1+)54株，占比84.4%。以(1+)为主。

2.2 沙门氏菌体外成膜生长曲线测定结果

在成膜能力不同的8株受试沙门氏菌中，成膜能力最强的时间点除2号菌为24 h外，其余均为36 h(图1)。

图1 8株受试沙门氏菌体外成膜生长曲线

2.3 沙门氏菌药敏试验结果

在69株受试沙门氏菌中，5株未成膜菌对23种抗菌药物的敏感率均为100%，而64株成膜菌对CRO、CFP、AZT、FEP、TZP和IPM 6种抗菌药物的敏感率为100%，对TET、DOX的耐药率最高，分别为76.6%(49/64)和75.0%(48/64)，成膜能力只与TET、DOX的耐药性呈正相关(P<0.05)(表2)。在64株成膜菌中有10株对7种及其以上的抗菌药物同时耐药，多重耐药率为15.6%，其中耐抗生素7种1株、8种3株、9种2株、10种1株、11种3株；10株多重耐药菌共呈现9种多重耐药谱，耐药模式70%为TET-DOX-AMX-AMP-TMP-SXT-FFC(表3)。

表2 69株受试沙门氏菌对23种抗菌药物的耐药率

表3 10株多重耐药沙门氏菌的耐药谱测定结果

2.4 沙门氏菌成膜菌与浮游菌MIC测定结果

根据沙门氏菌药敏试验和成膜能力测定结果，选择CIP、FFC、DOX、RAD 4种抗菌药物，对强阳性(3+)成膜菌2、45、47号进行MIC测定。浮游菌对CIP的MIC分别为2 048、128、1 024 mg/L，成膜菌为>4 096 mg/L、2 048 mg/L、>4 096 mg/L；浮游菌对FFC的MIC分别为512、256、512 mg/L，成膜菌为4 096、2 048、4 096 mg/L，而两者对DOX和RAD的MIC均>4 096 mg/L，其中成膜菌对CIP和FFC的MIC较对应浮游菌分别提高2倍～16倍和2倍～8倍。

2.5 沙门氏菌成膜菌在不同时间点MIC测定结果

在强阳性(3+)成膜菌2、45、47号中，2号成膜能力最强时间为24 h，此时对CIP和FFC的MIC均>4 096 mg/L，大于其他时间点的MIC。45号和47号成膜能力最强时间均为36 h，此时对CIP的MIC分别为2 048 mg/L(45号)、>4 096 mg/L(47号)，对FFC的MIC分别为2 048 mg/L(45号)、4 096 mg/L(47号)，均大于其他时间点的MIC。而对DOX和RAD，该3株受试菌在各时间点的MIC均大于4 096 mg/L(表4)。

表4 3株受试沙门氏菌在不同时间点的MIC

2.6 沙门氏菌LD50测定结果

在成膜能力不同的8株受试沙门氏菌中，强阳性(3+)成膜菌对小鼠的LD50值最大，与弱阳性(1+)成膜菌之间毒力差异显著(P<0.05)；而弱阳性(1+)成膜菌的LD50值与阴性(-)未成膜菌之间无显著差异(P>0.05)(表5)。

表5 8株受试沙门氏菌的LD50

3 讨论

在自然界中，细菌为适应生存环境常以形成BF的形式存在。BF的形成需经物理、生物及化学等一系列过程，与多种外界环境因素的变化密切相关。Piras F等[5]发现40株屠宰生猪源沙门氏菌在22℃时成膜阳性率为70.0%，(1+)为62.5%，(2+)为7.5%，而35℃时成膜阳性率为22.5%，全部为(1+)。Manafi L等[6]检测29株源自牛羊肉零售店的沙门氏菌，成膜总阳性率100.0%，(2+)为24.1%，(3+)为75.9%；其中源自牛肉制品沙门氏菌的成膜阳性率为48.3%，(2+)为85.7%，(3+)为14.3%，源自羊肉制品沙门氏菌的成膜阳性率为34.5%，(2+)为80.0%，(3+)为20.0%，源自肉品接触物表面沙门氏菌的成膜阳性率为20.7%，(2+)为60.0%，(3+)为40.0%。蹇慧等[7]检测了39株猪粪源沙门氏菌，成膜阳性率为97.4%，(1+)为35.9%，(2+)为12.8%，(3+)为48.7%；20株猪肉源沙门氏菌，成膜阳性率为40.0%，(1+)为30.0%，(2+)和(3+)均为5.0%。Nair A等[8]通过对源自临床、食品、家禽和环境中40株沙门氏菌的检测(成膜阳性率为85.0%，(1+)为67.5%，(2+)为17.5%)，提出不同地理区域和不同来源之间沙门氏菌的成膜能力无明显差异。本研究中，69株源自腹泻病仔猪沙门氏菌成膜阳性率为92.8%，(1+)为78.3%，(3+)为14.5%。综上表明，沙门氏菌具有普遍的成膜能力，温度、营养等因素均可影响BF的形成。虽然沙门氏菌的BF形成与其来源无明显相关性，但源自粪便的沙门氏菌成膜阳性率高于其他来源菌，一方面可能由于沙门氏菌在pH6.0左右的环境中最易形成BF，而仔猪肠道的pH在5.0～6.0之间有利于BF的形成，另一方面粪便中富含N、P等无机元素以及可能存在残留的抗生素，这些均可促进沙门氏菌BF的形成，同时有助于沙门氏菌BF形成的curli基因能在粪便中被激活。此外，不同来源沙门氏菌的成膜能力是否主要以(1+)为主，则有待进一步研究证实。

细菌一旦形成BF后会减低对抗生素的敏感性约100倍～1 000倍，主要基于BF具有阻碍抗生素扩散的屏障作用、减弱膜内细菌与抗生素反应的限制作用、利于耐药相关基因表达的促进作用等[9-11]。曾婷等[12]检测32株鲍曼不动杆菌的药物感受性，成膜菌对GM的耐药率较浮游菌显著升高(P<0.05)。Gnanadha D P等[13]利用冲击波将成膜沙门氏菌转变为浮游菌后，后者对CIP的MIC下降了100倍～1 000倍。Ju X等[14]在比对都柏林沙门氏菌对ERY、ROX、CST、PMB、STR、KAN等25种抗生素的MIC和MBC时发现，成膜菌较浮游菌的耐药性显著提高了约30 000倍。在本研究的69株沙门氏菌中，5株未成膜菌对23种抗生素均100%敏感，64株成膜菌则只对6种抗生素100%敏感，对TET、DOX耐药率高达75.0%，且成膜能力与对TET和DOX的耐药性呈正相关(P<0.05)。虽然64株成膜菌的多重耐药率不甚高(15.6%)，但其耐药范围广(至少耐7种抗生素)，耐药谱复杂(呈现9种多重耐药模式)。试验结果还显示，成膜菌对CIP和FFC的MIC较浮游菌分别提高了2倍～16倍和2倍～8倍。由此进一步表明，细菌形成BF后会降低对抗生素的敏感性，进而由于细菌耐药性的增强给临床药效提出了挑战。

目前，在人类的细菌感染中，约80%源自BF细菌，BF可作为细菌的毒力因子在致病性上发挥作用。然而，在细菌的致病过程中，BF可利用细菌的黏附结构增强自身的黏附性、抑制Ⅲ型分泌系统效应蛋白的表达而减弱细菌侵袭力、逃避宿主免疫反应使细菌大量增殖、引致细菌结构变异和某些毒力因子缺失或表达减弱等方式，影响成膜菌的毒力[15]。Daniela C等[16]研究结果显示，金黄色葡萄球菌最弱毒力株的成膜能力是最强毒力株的1.67倍。谭芳等[4]通过荧光定量PCR检测群体感应(quorum sensing,QS)系统相关基因的表达，发现QS相关基因rhlI、rhlR、rhlA、lasI、lasR、pqsA、pqsR在成膜菌中的表达量较浮游菌均显著增高。邱潇[17]探究了生物膜QS对铜绿假单胞菌毒力因子的调控作用，结果显示群感效应抑制剂香草醛能有效抑制绿脓菌素的产生，同时香草醛还能通过抑制motA基因的表达抑制细菌鞭毛介导的泳动能力。本研究中利用常规评价细菌毒力的LD50测定方法，比较了8株成膜能力不同的沙门氏菌，结果显示成膜能力越强，LD50值越大，从理论上讲该成膜菌毒力越弱。究其原因，细菌形成BF后阻碍了毒力因子的释放并对宿主的免疫反应产生抵抗，从而导致细菌的毒力减弱，LD50值增大。因此，将后续进行猪源沙门氏菌BF形成对相关毒力基因表达的影响研究。

尽管众多研究结果表明BF形成后增强了细菌的耐药性，而对细菌毒力的影响作用则呈现增强、减弱或未产生，这可能与细菌种类、耐药机制、毒力因子表达等不同有关[4,18]。然而，临床上许多慢性和难治性细菌感染与BF相关联。成膜菌侵染宿主时，BF作为抗原可刺激机体产生大量的特异性抗体，但由于BF的特殊结构，阻止了特异性抗体渗透以作用于膜内细菌，抗体则与BF表面的可溶性抗原结合形成免疫复合物，并沉积在感染病灶周围，吸引大量中性粒细胞浸润并释放蛋白水解酶，从而引起宿主严重的免疫损害、久治不愈，造成持续性感染，甚至终生带毒[19]。