骨髓间充质干细胞联合柴胡疏肝丸对大鼠急性肝损伤的作用研究
2021-08-31郑佳琳饶子亮黄小红黄小琼许惠英邝少松
郑佳琳，饶子亮，黄小红，武 昕，黄小琼，许惠英，邝少松
（广东省医学实验动物中心，广东佛山 528248）
目前，急性肝损伤在诸多急性临床病例中屡见不鲜，且呈现出逐年上升的趋势，严重威胁着人类的健康。柴胡疏肝丸主要用于治疗肝气郁滞证，而骨髓间充质干细胞疗法在肝脏疾病治疗领域中占据了非常重要的位置。因此，本课题研究急性肝损伤药物四氯化碳（CCl4）诱导大鼠急性肝损伤模型，以MSCs 联合柴胡疏肝丸对急性肝损伤进行治疗，观察是否具有改善大鼠肝功能的作用，初步探讨其作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物及实验环境
SPF级SD大鼠，雄性，100只，体重200～250 g，购于广东省医学实验动物中心[SCXK（粤）2018-0002]。动物饲养在广东省医学实验动物中心SPF级动物房[SYXK（粤）2018-0002]。动物饲养条件：5 只/箱，群养，饲养温度与湿度：20℃～26℃，40%～70%，采用10 h:14 h 昼夜间断照明；饲养室条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。自由进食饮水，饲料和饮用水均由广东省医学实验动物中心提供。
1.2 主要试剂与仪器
柴胡舒肝丸、四氯化碳（CCl4）、EA3001 系列电子天平、7020 型全自动生化分析仪。
1.3 细胞培养
体外大量培养大鼠骨髓间充质干细胞，选择处于对数生长期及状态良好的细胞进行给药治疗。
1.4 动物造模
将检疫合格的100 只SPF 级雄性SD 大鼠按照体重随机分为空白对照组、模型对照组、柴胡疏肝丸组、MSCs 组、联合用药组，每组20 只。除空白对照组外，其余大鼠以 2 mL/kg 剂量腹腔注射CCl4溶液（CCl4按1:1 比例与橄榄油混合配制成CCl4溶液）1 次，诱导大鼠产生急性肝损伤。
1.5 动物给药
造模后次日，MSCs 和联合用药组大鼠一次性尾静脉注射1.0×107个/ml 的MSCs；柴胡疏肝丸组和联合用药组大鼠灌胃给予70 g/kg 柴胡疏肝丸，空白对照组和模型对照组灌胃给予等量纯净水，每天1 次，连续给药7 d。
1.6 肝功能检测
开始治疗后的第1 天、第2 天、第3 天和第7 天，各组随机选取5 只大鼠，称重，CO2处死，采血分离血清，全自动生化分析仪测定肝功能指标，即谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）；收集肝脏组织并称重，计算肝指数。肝指数=肝湿重/体重×100%。
1.7 统计方法
实验所得数据用SPSS 21.0 软件进行统计，结果用（±s）表示，各组数据进行方差齐性检验，同时进行单因素方差分析，P ＜0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 治疗后大鼠肝指数变化
结果显示，对模型对照组大鼠注射CCl4后，模型对照组大鼠肝指数显著高于空白对照组（P＜0.05），说明造模成功。柴胡疏肝丸组、MSCs组和联合用药组大鼠肝指数在4 个时间点上均低于模型对照组。联合用药组大鼠肝指数显著低于模型对照组（P ＜0.05）。联合用药组肝指数与柴胡疏肝丸组、MSCs 组比较均有所降低，说明MSCs、柴胡疏肝丸对肝脏重量指数均起到缓解作用；联合治疗效果优于MSCs 和柴胡疏肝丸单独治疗的效果。随着时间的延长，各组肝指数都有所回落（表1）。
表1 治疗后的大鼠肝指数结果（±s，%，n=5，♂）
表1 治疗后的大鼠肝指数结果（±s，%，n=5，♂）
注：与空白对照组比较，*P ＜0.05；与模型对照组比较，△P ＜0.05。
组别d1d2d3d7空白对照组3.87±0.233.94±0.16 3.87±0.213.88±0.12模型对照组5.53±0.26*5.41±0.14*5.34±0.21*4.47±0.25*柴胡疏肝丸组5.49±0.28* 5.18±0.26*5.01±0.31* 4.04±0.25△MSCs组5.38±0.21*5.10±0.23*△ 5.07±0.24*3.97±0.22△联合用药组5.21±0.13*△4.74±0.17*△4.52±0.27*△3.92±0.12△
2.2 治疗后大鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）浓度变化
结果显示，在4 个时间点，模型对照组 ALT浓度明显高于空白对照组（P ＜0.05），柴胡疏肝丸组、MSCs 组和联合用药组 ALT 浓度明显低于模型对照组（P ＜0.05）。在 d7 时，联合用药组ALT 浓度与空白对照组基本持平，差异不显著（P＞0.05），肝功能恢复较好（表2）。
表2 治疗后的大鼠肝ALT 结果（±s，U/L，n=5，♂）
表2 治疗后的大鼠肝ALT 结果（±s，U/L，n=5，♂）
注：与空白对照组比较，*P ＜0.05；与模型对照组比较，△P ＜0.05。
组别d1d2d3d7空白对照组27±529±2 28±528±5模型对照组377±16*253±13*68±7*57±6*柴胡疏肝丸组352±10*△216±9*△46±6*△39±4*△MSCs组333±15*△195±14*△ 50±9*△38±7*△联合用药组252±16*△161±11*△45±8*△32±5△
2.3 治疗后大鼠血清中谷草转氨酶（AST）浓度变化
结果显示，在4 个时间点，模型对照组 AST浓度明显高于空白对照组（P ＜0.05）；除了d1柴胡疏肝丸组与模型对照组相比差异不显著（P＞0.05），其余时间点，柴胡疏肝丸组、MSCs 组和联合用药组 AST 浓度明显低于模型对照组（P＜0.05）。在d7 时，联合用药组AST 浓度与空白对照组基本持平，差异不显著（P ＞0.05），肝功能恢复较好（表3）。
表3 治疗后大鼠肝AST 结果（±s，U/L，n=5，♂）
表3 治疗后大鼠肝AST 结果（±s，U/L，n=5，♂）
注：与空白对照组比较，*P ＜0.05；与模型对照组比较，△P ＜0.05。
组别d1d2d3d7空白对照组120±12125±10 123±16122±13模型对照组297±11*232±21*204±18*180±13*柴胡疏肝丸组286±10* 211±7*△179±12*△161±11*△MSCs组244±19*△195±14*△ 172±15*△157±15*△联合用药组194±12*△146±14*△144±9*△136±14△
3 讨论
MSCs 是存在于骨髓中具有自我增值和自我更新能力的一种成体干细胞，具有高增殖和多向分化潜能，易于采集、分离纯化和体外扩增，是肝细胞重要的肝外来源[1]。在细胞治疗、基因治疗中具有广泛的应用前景。近年来证实，MSCs 对急性肝损伤的修复作用，已经得到了干细胞领域和肝病学领域的公认[2]。
急性肝损伤是多因素参与的一个复杂病理过程，病变过程中多种酶、自由基以及脂质过氧化反应均发生着较大的变化，其中氧自由基对肝细胞DNA 结构及其他代谢过程有较大的影响，从而成为了急性肝损伤的重要致病因素[3]。
柴胡疏肝丸中的柴胡能疏肝气、养肝阴，具有抗脂质过氧化作用，对保护肝细胞和恢复肝脏某些功能有一定的作用，白芍养肝柔肝，对氧自由基有清除作用[4]。这一生物学特性，使柴胡疏肝丸具有了缓解急性肝损伤病程，抑制肝损伤程度，从而具有了治疗急性肝损伤的应用潜能。
综上所述，MSCs 联合柴胡疏肝丸对大鼠急性肝损伤进行治疗，在修复肝脏组织和抑制损害程度方面实现对受损肝脏组织的修复和治疗，呈现更加显著的治疗效果。
