氟苯尼考对人工感染多杀性巴氏杆菌小白鼠的防治效果研究

何杰珩，刘广超，马 驿，彭金菊，丁月霞

（广东海洋大学滨海农业学院，广东 湛江 524088）

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）是一种非运动性的革兰阴性杆菌， 无鞭毛， 不形成芽孢，瑞氏染色或美蓝染色可见典型的两极着色。该菌是兼性厌氧菌，对营养要求较严格，在血琼脂平板上生长良好。该菌血清学种类众多，大多数菌株有荚膜，起抗吞噬作用［1-3］。

病原为多杀性巴氏杆菌的巴氏杆菌病是一种具有高度传染性的人畜共患呼吸系统疾病， 临床特征是急性败血症和组织器官的出血性炎症，主要通过消化道和呼吸道感染，可快速传播，给人类健康和畜禽养殖业带来较大威胁［4-6］。

在治疗巴氏杆菌病时， 使用抗生素是控制感染的有效方法。 随着大量抗生素广泛且不合理应用，各种耐药菌株源源不断地出现，大大降低了抗生素的应用效果，有资料表明，已有80.5%的多杀性巴氏杆菌对微生物抗性有限的抗生素表现出耐药性［7］。 该研究旨在利用微量肉汤稀释法筛选出体外抑菌效果好的药物，观察其防治效果，为其临床推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：多杀性巴氏杆菌标准菌株（C48-3），由中国兽医药品监察所提供。

药物：替米考星预混剂（20%），盐酸多西环素可溶性粉 （10%）， 延胡索酸泰妙菌素预混剂（80%），盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉（大观霉素10%与林可霉素5%）， 均由山东鲁抗舍里乐药业有限公司生产； 硫酸新霉素可溶性粉（32.5%），酒石酸泰乐菌素磺胺二甲嘧啶可溶性粉（20%），氟苯尼考粉（10%），复方磺胺间甲氧嘧啶钠可溶性粉（10%），阿莫西林可溶性粉（10%），由佛山市南海东方澳龙制药有限公司生产。

实验动物：昆明种小白鼠90 只，体重18～22 g，雌、雄各半，购自广东医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 多杀性巴氏杆菌菌液的制备 将多杀性巴氏杆菌菌种接种于肉汤培养基中，37 ℃恒温培养18～24 h 后，将菌液接种于10 mL 肉汤培养基并置于37 ℃恒温箱培养16～18 h， 采用平板计数法计数，用营养肉汤稀释至105CFU/mL。

1.2.2 MIC 的测定 采用微量肉汤稀释法，于96孔板每排的各孔加入一定量上述稀释好的菌液，再将稀释好的抗菌药物加入第1 孔， 依次倍比稀释至第11 孔，第12 孔不加药物作为菌液对照，使得1～11 孔中药物浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。每种药物重复3 次。37 ℃恒温培养18～24 h 后观察结果。

1.2.3 MBC 的测定 在MIC 试验基础上， 将上述MIC 检测的澄清的各孔37 ℃恒温培养48 h后，从每孔吸取10 μL，分别涂布于营养肉汤琼脂平板培养基上，37 ℃恒温箱培养（18～24 h）。 以琼脂平板孔内无细菌生长且药物最小的浓度为该种药物对该种菌株的MBC。 每种药物重复3 次，如果有2 次结果相同则以相同结果为准。

1.2.4 人工感染多杀性巴氏杆菌小白鼠的防治试验 将多杀性巴氏杆菌接种于1%兔血清营养肉汤中，37 ℃恒温培养8～12 h， 采用平板计数法计数，用肉汤稀释至所需浓度。 随机选取45 只小白鼠进行治疗试验， 另外45 只小白鼠进行预防试验。两组试验分别设阴性对照、阳性对照及氟苯尼考组。 将预试验筛选能引起小白鼠在感染后24 h死亡率超过70%的多杀性巴氏杆菌菌液浓度作为攻毒浓度。预试验确定阳性对照组每只小白鼠皮下注射浓度为103CFU/mL 的多杀性巴氏杆菌混悬液0.1 mL，阴性对照组每只小白鼠皮下注射生理盐水0.1 mL。

1.2.4.1 治疗试验 攻毒当天，阴性对照组15 只小白鼠， 皮下注射生理盐水0.1 mL； 阳性对照组15 只小白鼠，皮下注射浓度为103CFU/mL 的多杀性巴氏杆菌混悬液0.1 mL；另外15 只小白鼠于颈背部皮下注射氟苯尼考药液，按每千克体重20 mg原药粉剂标准，连续给药5 d，停药后观察10 d。

1.2.4.2 预防试验 阴性对照组15 只小白鼠，皮下注射生理盐水0.1 mL； 阳性对照组15 只小白鼠，皮下注射浓度为103CFU/mL 多杀性巴氏杆菌混悬液0.1 mL； 另外15 只小白鼠按每千克体重30 mg 原药粉剂标准， 连续灌服氟苯尼考药液5 d后， 皮下注射与阳性对照组相同浓度和剂量的多杀性巴氏杆菌混悬液， 自攻毒之日开始连续观察10 d。 统计各组死亡小白鼠数量，计算氟苯尼考对感染小白鼠的保护率。

防治效果用保护率进行评价： 保护率 （%）=（阳性感染对照组的死亡数-药物试验组死亡数）/阳性感染对照组的死亡数×100%。

按常规检验方法解剖死亡小鼠进行观察，分离体液及组织中的细菌镜检； 并将病料无菌接种于鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板，37 ℃培养18～24 h，挑取单个菌落，进行纯培养，观察菌落生长情况，涂片镜检，确定死亡原因。

2 结果与分析

2.1 抗菌药物对多杀性巴氏杆菌的体外抑制效果

抗菌药物对多杀性巴氏杆菌的体外抑制效果见表1，9 种抗菌药物中， 氟苯尼考和多西环素的抑菌效果和杀菌效果相同且最强，MIC 均为1 μg/mL，MBC 均为2 μg/mL；延胡索酸泰妙菌素的MIC为64 μg/mL，MBC 为128 μg/mL，抑菌效果和杀菌效果最差。

表1 不同抗菌药物对多杀性巴氏杆菌的体外抑制效果 单位：μg/mL

2.2 人工感染多杀性巴氏杆菌小白鼠的防治效果

2.2.1 药物治疗试验结果 选择氟苯尼考作为研究对象， 开展人工感染多杀性巴氏杆菌小白鼠的防治效果试验，结果见表2。 阴性对照组小白鼠未攻毒和治疗，死亡率为0；攻毒后的阳性对照组小白鼠死亡13 只，死亡率为86.7%，大多数小白鼠死亡时间集中在攻毒后12 h 内；注射氟苯尼考药物组的小白鼠死亡2 只， 死亡时间分别为攻毒后28 h 和72 h， 与阳性对照组比较， 死亡率明显下降，仅为13.3%，氟苯尼考对小白鼠感染多杀性巴氏杆菌的保护率为84.6%。

表2 氟苯尼考对人工感染多杀性巴氏杆菌小白鼠的治疗效果

2.2.2 药物预防试验结果 未感染多杀性巴氏杆菌的小白鼠没有出现死亡， 攻毒后阳性对照组小白鼠死亡14 只，死亡率为93.3%，大多数小白鼠死亡时间集中在攻毒后12 h 内；灌服氟苯尼考药物组的小白鼠在攻毒后21～22 h 内陆续死亡3只，死亡率与阳性对照组比较，下降20%，灌服药物组的存活率高于阳性对照组， 氟苯尼考对小白鼠感染多杀性巴氏杆菌的保护率为78.6%， 预防试验结果见表3。

表3 氟苯尼考对人工感染多杀性巴氏杆菌小白鼠的预防效果

2.3 死亡小白鼠解剖特征

解剖15 只死亡小白鼠， 发现大多数四肢末端、耳、鼻、口唇发绀或苍白，耳部偶见充血、瘀血；趾（指）部末端出血，牙龈有散在出血点；皮下广泛性出血，有出血斑，有大量淡黄色或黄色胶冻样浸出物；胸骨、心外膜有出血点和出血斑；肺出血、瘀血，代偿性气肿，呈现“花斑肺”或“橡皮肺”样外观；胸腔、心包纤维素性炎，胸膜与肺、心包粘连，胸腔积液； 腹腔有大量黄白色腹水， 有干酪样物质，内脏器官广泛性粘连，脂肪出血；肝脏充血、瘀血，有灰白色坏死斑，部分胆囊高度充盈；脾脏瘀血、肿大，内部有散在大小均一的白色结节；胃内容物有大量黄色或淡黄色气泡； 肠黏膜充血、瘀血，肠腔内含有淡红色或黄绿色液体；肾脏表面有灰白色坏死灶；子宫和卵巢充血、出血、瘀血。

2.4 细菌分离、鉴定结果

及时将剖检死亡小白鼠肺、肝、脾等病料进行细菌的分离培养，在普通培养基上生长贫瘠，在麦康凯培养基上不生长，在鲜血培养基上生长良好，呈淡灰白色、闪光的露珠状小菌落，且无溶血现象（见图1）。 选用新鲜的病变组织涂片，经瑞氏和美蓝染色后，光学显微镜下检查；涂片染色分离培养的细菌，光学显微镜下检查。 分离菌呈现球杆状或短杆状，两端钝圆，以单个和成双排列为主，革兰染色阴性（见图2），涂片用美蓝染色时可见典型的两极着色。

图1 血平板上多杀性巴氏杆菌形态

图2 油镜下多杀性巴氏杆菌形态

3 讨论

3.1 不同抗菌药物对多杀性巴氏杆菌的抑菌效果

据报道，多杀性巴氏杆菌分离菌对氟苯尼考、阿莫西林—克拉维酸、 恩诺沙星和磺胺甲氧嘧啶敏感，而对四环素、红霉素和庆大霉素的敏感性较低［8］；而氨基糖苷类、万古霉素、红霉素和克林霉素与青霉素相比，抗菌效果较差；头孢菌素和氟喹诺酮则是最有效的药物。但在耐药性方面，磺胺类药物的耐药率最高，其次是青霉素和红霉素［9］。

该试验中， 硫酸新霉素和盐酸大观霉素属于氨基糖苷类抗菌药， 对多杀性巴氏杆菌的抑菌效果较差，与上述文献资料相同；泰乐菌素和替米考星属于大环内酯类抗菌药， 替米考星对多杀性巴氏杆菌的抑菌效果稍强于泰乐菌素， 与其他文献资料结果相似， 但是近年来发现替米考星的耐药菌株越来越多；氟苯尼考属于酰胺醇类抗生素，对多杀性巴氏杆菌有较好的抗菌活性， 且对耐氯霉素、甲砜霉素的细菌敏感。 有研究表明，氟苯尼考对鸡多杀性巴氏杆菌的MIC 为0.5 μg/mL，可能与试验所用菌株不同有关。 多西环素属于四环素类抗生素，具有广谱抑菌作用；泰妙菌素属于截短侧耳类抗菌药，对猪链球菌、金黄色葡萄球菌呈现较好的杀菌效果， 对多杀性巴氏杆菌的抑菌效果较差。 该试验中所用的磺胺药物是酒石酸泰乐菌素磺胺二甲氧嘧啶， 属于两种抗菌药物联合使用，其抑菌效果好是否与泰乐菌素联用有关还有待验证。

3.2 氟苯尼考对人工感染多杀性巴氏杆菌小白鼠的防治效果

氟苯尼考是动物专用的广谱、抑菌抗生素，对许多革兰阳性和阴性的细菌有效， 对呼吸道感染和肠道感染也有较好的疗效。同时，与同属四环素类抗生素的氯霉素相比，氟苯尼考更加具有优势，用药后不会产生再生障碍性贫血的不良反应［10］。

该试验中， 选用氟苯尼考预防和治疗小白鼠的多杀性巴氏杆菌感染， 其预防试验和治疗试验的保护率分别为78.6%、84.6%， 对小白鼠感染多杀性巴氏杆菌具有较好的疗效。 而所谓 “防重于治”，一般情况下药物对动物的预防效果优于治疗效果，但是与其他文献的研究结果不同的是，该试验数据表明氟苯尼考预防试验的保护率低于治疗试验；可能是因为预防试验小组中选择“灌服”的投药方式， 在一定程度上对小白鼠造成损伤以及较大的应激，从而导致其死亡率上升。 另外，相比阳性对照组小白鼠， 预防试验组中小白鼠的临床症状比较轻，消瘦程度有所改善，第一只小白鼠死亡时间延迟9 h；治疗试验组中小白鼠无明显临床症状，多是急性死亡，死亡时小白鼠无明显消瘦，第一只小白鼠死亡时间延迟16 h。

解剖发现， 死亡小白鼠普遍存在全身多发性出血，心包、胸腔和腹腔纤维素性变化，可见黄色干酪样物质；病程较长、尸体消瘦的小白鼠肺部病变较明显，肺间质增生。巴氏杆菌病的临床特征是急性败血症和组织器官的出血性炎症， 引起动物发生出血性败血症或传染性肺炎［5］，这与该试验的肺部病变结果相似。

有研究表明，90%以上的牛和猪感染多杀性巴氏杆菌，对氟苯尼考敏感［11］；而经氟苯尼考治疗的山羊与未接受任何抗生素治疗的对照组山羊相比，有显著的临床改善，氟苯尼考对由多杀性巴氏杆菌引起的山羊感染是最有效的抗生素之一［12］；氟苯尼考低、中、高剂量均对鸡多杀性巴氏杆菌病有较好的疗效。 因此，在病例治疗中，为尽量避免多种药物联合使用带来的副作用和不良反应，以及细菌耐药性的产生， 建议尽早使用抑菌效果较好的抗生素，并制定合理的疗程，保持一定的血药浓度，尽快控制病情。