高效阴离子交换色谱-脉冲积分安培法检测海带中的单糖、双糖和糖醛酸

尹大芳，孙晓杰，郭莹莹，李 娜，田 雨，王联珠,*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071）

海洋资源丰富，海洋生物含有丰富的糖类、蛋白质、矿物质等营养物质，相对于陆生资源具有更高的营养以及更高的开发价值[1]，海藻的加工以及高值化利用成为海洋资源综合利用的重要领域[2]。海带含有海带多糖、优质蛋白质、氨基酸、纤维素等多种生物活性成分，具有利水消肿和御寒等功效。海带多糖在降血糖[3]、抗肿瘤[4]、抗氧化[5]和神经保护[6]等方面具有重要的生物学活性。但由于多糖结构复杂，其生物活性机制研究仍然是一个难题。单糖组成和含量对生理活性有极大影响[7-8]，是多糖基础性和关键性的研究环节[9]。单糖是一种多羟基醛酮化合物，极性强，无发色官能团和荧光官能团，结构相似，存在同分异构体，对分离条件的要求较高。

常用的单糖定性定量方法有高效液相色谱法[10-14]、气相色谱法[15]、毛细管电泳法[16-18]和高效阴离子交换色谱法[19-21]等。高效液相色谱联合示差折光检测器和蒸发光散射检测器无需衍生，操作简便，但选择性和灵敏度差[10-12]。由于单糖没有发色基团、荧光基团以及没有挥发性，采用紫外、荧光检测器以及气相色谱检测时，常需要进行柱前柱后衍生化[14-15]。衍生化过程费时繁琐，常伴随衍生过程不彻底或生成多种衍生物，阻碍了糖类检测技术的发展[15,22-24]。毛细管电泳法灵敏度低和重复性差的特点极大限制其应用[17-18,20]。高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD）法是一种强有力的分析糖类化合物的检测技术。以电化学检测器作为检测器，高选择性的阴离子交换柱作为固定相，选择最新优化的四电位检测波形，负电位清洗电极，正电位氧化并激活电极，可有效降低电极的损耗，延长电极寿命以及增加实验的重复性[25]；羟基的氧化电位较低（0.1 V），所以基体干扰少，方法的重复性和准确性高[26]。NaOH溶液作为淋洗液，改变NaOH浓度，可影响溶液中分子形成氢键的能力，导致其与固定相结合能力的差异实现糖类分离。电化学检测器与梯度淋洗液的相容性，结合阴离子交换固定相的高选择性，可根据糖分子结构间的细微差别，几乎可达到所有类别的醛糖醇的分离，检出限低至10-12～10-15mol[25]。该方法具有操作简单，灵敏度、选择性、准确度高和重复性好的特点。HPAECPAD已应用于各种常规监测和研究领域，包括牛奶[27]、谷类[28]、中草药[21]、玉米淀粉[29]以及细胞培养[9]等各种材料中单糖、双糖、寡糖的检测等，但水产品中糖类种类较为复杂，应用较少。此外，针对水产品的中性糖和糖醛酸同时检测的应用较少。

因此，本实验采用Dionex ICS-3000离子色谱系统，联合脉冲安培检测器，以CarboPac PA10（250 mm×4 mm）作为糖分析柱，考察淋洗液浓度、色谱柱柱温和淋洗液流速对各组分分离的影响。采用梯度洗脱对常见的11 种糖类化合物进行分离定量，建立同时定性定量分析11 种糖类化合物的方法，利用该方法对海带多糖水解后单糖组分进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品分别采购自山东威海、辽宁大连、福建霞浦海域；11 种糖类标准物质：岩藻糖（fucose，Fuc）、葡萄糖（glucose，Glc）、氨基半乳糖（galactosamine，GalN）、氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）、半乳糖（galactose，Gal）、甘露糖（mannose，Man）、果糖（fructose，Fruc）、核糖（ribose，Rib）、乳糖（lactose，Lac）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，Gal UA）和葡萄糖醛酸（glucuronic acid，Glc UA）（纯度均不小于98%），50%氢氧化钠（色谱纯）、乙酸钠（分析纯） 美国Sigma公司；实验用水均采用电阻率不低于18.2 MΩ·cm的超纯水；无水乙醇、氯仿、正丁醇、三氟乙酸均属国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Dionex ICS-3000离子色谱系统、CarboPac PA10糖分析柱（250 mm×4 mm）、CarboPac PA10糖保护柱（50 mm×4 mm） 美国戴安公司；FDU-2110高速冷冻离心机 德国Heidolph公司；DFY-300型摇摆式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司；ZRD-A7080全自动新型鼓风干燥箱 上海智试分析仪器公司；Milli-Q超纯水设备 美国Milipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液和淋洗液的配制

标准储备液：用超纯水将各糖类化合物标准溶液均配制成1 mg/mL的母液。取适量母液配制成一定质量浓度的混合标准溶液。

200 mmol/L NaOH淋洗液：取50% NaOH溶液10.4 mL，用超纯水定容至1 L。

500 mmol/L NaAc淋洗液：称取NaAc固体20.5 g，用超纯水溶解并定容至500 mL；淋洗液配制完成后立即通氮气摇匀备用。

1.3.2 样品前处理

多糖提取：参照文献[30]的方法。洗净海带表面泥沙等杂质，在50 ℃烘箱中烘干，打碎成海带粉，-20 ℃保存备用。1.0 g海带粉加入10 倍的无水乙醇静置12 h，取沉淀于50 ℃干燥箱中干燥至恒质量；加入30 倍超纯水，利用超声细胞粉碎机处理30 min，置于60 ℃恒温水浴锅中浸提30 min，离心取上清液，于60 ℃旋蒸至原体积的1/4，加无水乙醇至体积分数80%，4 ℃过夜，离心，取沉淀复溶于水，利用Sevag法（正丁醇-氯仿，1∶5，V/V）除蛋白后，用2 mol/L三氟乙酸溶液于120 ℃恒温干燥箱中水解2 h；水解完成后NaOH中和水解液，离心，去沉淀，经0.22 μm滤膜过滤，用于进样分析。

1.3.3 色谱条件

采用CarboPac PA10（250 mm×4 mm）作为糖分析柱，CarboPac PA10（50 mm×4 mm）作为糖保护柱，脉冲安培检测器，糖标准四电位（表1）作为检测波形，水-NaOH-NaAc组成三元淋洗液，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为25 μL。淋洗液系统最终优化洗脱程序见表2。梯度洗脱程序可分为单双糖的分离、糖醛酸的分离、基质的消除、赋予色谱系统强pH值、色谱柱的平衡5 个阶段。利用保留时间进行定性，外标法（峰面积）进行定量计算。图1为质量浓度10 mg/L混合标准溶液色谱图。

图1 11 种糖类混合标准溶液色谱图Fig. 1 Chromatogram of mixed solution of 11 sugar standards

表1 糖标准四电位波形Table 1 Quadruple-potential waveform for carbohydrate detection

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program

2 结果与分析

2.1 淋洗液优化

糖类具有复杂的空间结构，对于一些差向异构体的单糖（如Glc与Gal、Man）pKa相近，易形成共洗脱，较难分离[31]。通过淋洗液的浓度改变淋洗液的pH值，从而改变糖类化合物的质子解离程度，达到有效的分离。糖类在色谱柱上保留性质与糖类的pKa值具有重要的相关性，表3为部分糖类化合物的pKa值。相同的碱性环境中，pKa值越大，其酸性越弱，糖类解离度越差，与固定相结合能力越弱，越容易洗脱；糖类在阴离子交换分离柱的洗脱顺序依次为单糖、双糖、糖醛酸。糖醛酸是糖的衍生产物，比相应的单糖多了羧酸基团，酸性较强，在阴离子交换柱上的保留性强。

表3 部分糖类化合物的pKa值（水中，25 ℃）Table 3 pKa value of some sugars (in water at 25 ℃)

针对11 种糖类化合物的洗脱条件优化，本实验分为2 部分完成：第1部分为8 种单糖和1 种双糖（Fuc、Glc、GalN、GlcN、Gal、Man、Fruc、Rib和Lac）的洗脱优化，中性糖在色谱柱上的保留时间相对较短，其单糖结构相似，具有同分异构体，淋洗液浓度对其洗脱具有决定性作用；第2部分为糖醛酸（Glc UA和Gal UA）的洗脱优化，糖醛酸的pKa值小，偏酸性，在色谱柱上的保留时间长，NaOH溶液作为洗脱剂时，很难对糖醛酸分离洗脱；而NaAc与固定相的亲和力强，Ac-洗脱能力强于OH-，因此，使用NaAc对糖醛酸进行洗脱实验。

2.2 单糖和双糖的等度洗脱实验

2.2.1 淋洗液选择

选取5、10、20、25、30 mmol/L NaOH溶液对9 种糖类化合物进行等度洗脱，考察对色谱峰的分离度与峰形的影响，结果如图2所示。实验过程中发现：淋洗液NaOH浓度低于5 mmol/L时，色谱峰展宽，分析时间较长，洗脱时间超过60 min；淋洗液为10 mmol/L NaOH溶液时，Fuc、Glc、GalN三种单糖之间的分离度较高，峰形较好，但对于较难洗脱的组分（Gal、Man、Fruc和Rib）间的分离度较差，且洗脱时间相对较长，超过40 min。当淋洗液NaOH浓度为20 mmol/L时，各单糖之间分离较好。当淋洗液NaOH浓度继续增大时，分析时间逐渐缩短，色谱峰峰形变尖，分离度呈现下降趋势。

图2 NaOH浓度对9 种糖类化合物分离效果的影响Fig. 2 Influence of NaOH concentration on chromatographic separation of nine sugars

随NaOH浓度的增大，各个色谱峰保留时间缩短，响应值增高。这可能是由于NaOH浓度的变化可以改变溶液中OH-浓度、溶液pH值以及糖类在溶液中的解离度。随OH-浓度增加，糖类的解离度增大，导致在固定相上的保留时间延长；但是，随OH-浓度增加，淋洗液的洗脱能力增强，亦可使糖类在固定相上的保留时间缩短。其中，后者占据主导优势。在考虑分离度、色谱峰的峰形、分析时长等因素的情况下，选择20 mmol/L NaOH溶液作为流速与温度优化程序的固定条件。

2.2.2 流速选择

以20 mmol/L NaOH溶液作为淋洗液，设定淋洗液的流速分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min，考察流速对9 种组分的色谱峰分离度与峰形的影响，结果如图3所示。结果表明，流速低时分析时间长，峰形变宽，柱效降低，对于易洗脱的单糖（Fuc、Glc、GalN、GlcN和Gal）分离度更高，峰形更好；流速的变化对于Man、Fruc、Rib和Lac等较难洗脱的糖类化合物则影响较小；流速高时，柱压升高，各糖类化合物分离度变差。考虑分离度、色谱柱压力、色谱柱柱效及分析时长等因素，选择1.0 mL/min作为最终流速。

图3 流速对9 种糖类化合物分离效果的影响Fig. 3 Influence of mobile phase flow rate on chromatographic separation of nine sugars

2.2.3 温度选择

以20 mmol/L NaOH溶液作为淋洗液，流速为1.0 mL/min，改变色谱柱温度分别为20、25、30、35、40 ℃，观察各组分间分离度和峰形的变化，结果如图4所示。当柱温在25 ℃及以下时，分离度相对较好。柱温在30 ℃以上时，糖类化合物的分离度变差，且不能实现Glc和GalN的分离。

图4 温度对9 种糖类化合物分离效果的影响Fig. 4 Influence of column temperature on chromatographic separation of nine sugars

结果显示，随温度升高，色谱峰的保留时间呈减小趋势。这是由于糖类在色谱柱的保留属于放热行为，不同糖类化合物间受影响的程度不同，一般规律为随糖类化合物相对分子质量的增大，保留时间的影响程度增大[32]。柱温对HPAEC分离单糖具有重要的影响，很小的温差变化（±5 ℃）便会引起单糖保留时间的偏移，影响方法的重复性。考虑到分离度、峰形以及仪器耐受性等因素，选择25 ℃作为色谱柱温度。

2.3 单糖、双糖和糖醛酸的梯度淋洗液系统的确定

Fuc、Glc、GalN和Gal四种糖类化合物的保留时间较短，低浓度的NaOH溶液可达到较好的分离效果。Man、Fruc、Rib和Lac在固定相中的保留性较强，需采用较高浓度的NaOH溶液进行洗脱分离。但洗脱过程中不可遽然改变淋洗液浓度，否则基线漂移严重，影响后续定量。采用在0～35 min内，10～52 mmol/L NaOH作为梯度洗脱实现对单糖和双糖的洗脱。糖醛酸在色谱柱上保留性强，若单独使用200 mmol/L NaOH进行洗脱，洗脱时间长达60 min。需加入强洗脱剂NaAc溶液（与色谱柱亲和度更高）作为淋洗液，最终确定以200 mmol/L NaAc+80 mmol/L NaOH对糖醛酸进行洗脱。在完成检测过程后，采用与固定相亲和力更强的NaAc对保留性更强的杂质进行清除，本实验采用500 mmol/L NaAc作为基质消除洗脱液。淋洗液系统的最终优化洗脱程序见表2，总运行时间为90 min。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线

分别配制质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 mg/L的11 种糖类化合物的混合标准溶液，以质量浓度（x，mg/L）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。各组分的保留时间、线性关系、线性范围、相关系数、检出限（RSN=3）、定量限（RSN=10）见表4。11 种糖类化合物在各自线性范围内线性关系R2不小于0.998 6，方法的检出限（RSN=3）在1.27～47.49 mg/kg之间。

表4 线性数据和检出限Table 4 Linearity and limits of detection and quantification

2.4.2 精密度结果

对日内精密度和日间精密度进行考察，分别从保留时间和峰面积2 个方面进行测定。在优化的色谱条件下，对质量浓度10 mg/L的混合标准溶液连续进样7 次计算日内精密度，各单糖保留时间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均小于0.259%，峰面积的RSD均小于1.69%。将10 mg/L的混合标准溶液1 d进样3 次，连续进样4 d，计算日间精密度。各单糖保留时间的RSD均小于0.27%，峰面积的RSD均小于1.78%。结果见表5。

表5 精密度实验结果Table 5 Results of precision experiments

2.4.3 加标回收率结果

对海带多糖的水解液进行加标回收率实验，对于样品中含有的单糖，以样品中单糖质量分数的50%、100%、200%进行加标，对于样品中不含的糖类，以1、2、4 mg/L进行加标实验，重复进样7 次，计算峰面积的RSD。由表6可知，样品加标回收率在89.35%～115.67%之间。

表6 加标回收率实验结果（n=7）Table 6 Results of spiked recovery experiments (n = 7)

2.5 样品的测定

采用1.3.2节方法对8 份海带样品进行前处理，采用1.3.3节色谱条件进样分析，其中山东威海海之宝海域的1号样品及其样品加标色谱图见图5。每批样品平行测定3 次，取平均值，得到海带样品的糖类组成和含量，结果见表7。

图5 海带样品及其加标色谱图Fig. 5 Chromatograms of polysaccharides in real and spiked samples of Laminaria japonica

表7 实际样品糖类化合物含量（n=3）Table 7 Contents of sugars in actual samples determined by the developed method (n = 3) mg/g

3 讨论与结论

水产品中多糖结构复杂，单糖种类多样，单糖间分离难度较大。色谱柱的选择是影响单糖分离的重要因素，CarboPac PA1、CarboPac PA10以及CarboPac PA20阴离子交换柱常用来分离单糖、双糖。CarboPac PA1分析糖类时具有明显的溶解氧负峰，且CarboPac PA1的灵敏度较CarboPac PA10和CarboPac PA20低[25]；CarboPac PA10和CarboPac PA20色谱柱的填料大致相似，不同的是CarboPac PA10色谱柱树脂基核及覆盖在树脂表面的键合是由双功能乳胶构成，而CarboPac PA20则是由季铵功能基乳胶构成，CarboPac PA10容量相对更大[33]。本实验对中性糖和糖醛酸同时进行分离，需采用较大容量的色谱柱。CarboPac PA10由乙基乙烯基苯-二乙烯基苯聚合形成的基核，表面附聚具有疏水性的双功能乳胶颗粒，容量为100 mol/柱，对溶解氧的保留性更强，可有效避免氧负峰[34]。最终选取CarboPac PA10作为11 种糖类组分分析的阴离子色谱柱。

本研究建立梯度洗脱-HPAEC-PAD分析Fuc、Glc、GalN、GlcN、Gal、Man、Fruc、Rib、Lac、Glc UA和Gal UA 11 种糖类化合物的检测方法，实现了对中性糖、氨基糖和糖醛酸的同步分离，且11 种糖均达到基线分离，线性关系良好，精密度高。对海带多糖水解液进行加标回收率实验，其加标回收率在89.35%～115.67%之间。相对于其他检测方法（如高效液相色谱法）可分析的单糖种类来看，HPAEC-PAD可检测的种类更多，更全面，分离度更高。相对于气相色谱等其他需衍生化的检测方法看，操作更为简便、高效。结果表明，该方法具有操作简便易行，分离度、灵敏度、精密度高，重复性好等特点。