冬夏季节对猪皮制备的明胶凝胶特性和溯源性的影响

沙小梅，王光耀，胡姿姿，胡文芸，涂宗财,2*

1(江西师范大学 国家淡水鱼加工技术研发专业中心和江西省淡水鱼高值化利用工程技术研究中心，江西 南昌，330022)2(食品科学与技术国家重点实验室(南昌大学)，江西 南昌，330047)

明胶是由胶原蛋白经适度水解后得到的一类高分子蛋白质，主要从动物的皮肤、骨等结缔组织进行提取[1],其具有凝胶性、发泡和乳化特性等多种功能特性，因而在食品、医药、化妆品和其他行业有广泛的应用[2-3]。目前，约有95%的食用明胶来自哺乳动物，主要为猪和牛[4]。猪明胶是市场上使用最广泛的明胶，但因手足口病的爆发，使其安全性受到消费者的质疑；其次受宗教信仰和素食主义的影响，使得对猪明胶进行溯源而备受关注[5]。目前，食用明胶的溯源常见的方法主要有PCR，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，电泳技术和傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)等[6-9]。但由于食用明胶尤其是哺乳动物明胶的序列同源性非常高，其前体胶原蛋白的氨基酸序列相似度高达95%，且不同哺乳动物明胶之间的差异仅存在于一级结构的部分氨基酸序列中，给溯源带来很大困难，导致上述溯源方法难以确认溯源效果，同时以上方法仅能用于纯明胶的溯源，不适用于明胶混合物。

近年来，质谱技术逐渐代替传统方法成为溯源蛋白质的新方法，其原理是依据胶原蛋白氨基酸序列之间的细微差异搜索不同来源的特征多肽，从而准确追溯明胶来源。质谱溯源因其快速、准确的特点而被广泛关注，如WARD等[10]成功地借助生物质谱技术鉴定出源于猪、牛、鱼和鸡的4种明胶；在工业明胶的鉴定中，KUMAZAWA等[11-12]利用LC-MS成功鉴别出来源于猪、马、牛、山羊和绵羊的不同明胶；GRUNDY等[13]用质谱技术追溯食品和药品中明胶的来源，其结果比使用ELISA和PCR方法的效果更好。目前，食用明胶的研究大多数都集中在明胶混合物和食品体系中明胶来源的鉴定，而原料对于猪皮明胶溯源性影响的研究较少[14]。

食用明胶的原料主要为猪皮、牛皮和驴皮，其中猪皮占主导地位。皮肤为动物感知外界环境的感受器，其对于外界环境变化十分敏感，尤其是温度。此前，相关研究证明不同季节肌内胶原蛋白的结构有所差异[15-16]，继而推测不同季节的猪皮胶原蛋白也具有类似的差异。通过文献查询发现，夏季和冬季的鱼皮明胶在凝胶特性方面有所差异[17]，但不同季节对猪皮明胶凝胶特性和溯源影响的相关研究尚未见报道，因此值得深入探究。在4个季节中，冬季和夏季的温度差异最大，故选择冬季和夏季宰杀之后得到的猪皮为原料提取明胶，应用剪切应力流变仪和质构分析仪对猪皮明胶的凝胶特性(如凝胶强度，胶融温度和胶凝温度)进行分析，探究冬季和夏季的猪皮原料是否会对提取明胶的凝胶特性产生影响；同时，应用线性离子阱高分辨率质谱技术(linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry，LTQ/Orbitrap MS/MS)研究冬夏季节猪皮明胶的溯源性差异。本研究通过探究冬夏季节猪皮明胶凝胶性能的差异以及寻找不随季节变化的猪皮明胶特征多肽，为猪皮明胶的溯源数据库提供一定的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

猪皮，正邦集团(江西南昌)，品种均为三元猪(即长白猪和大白猪杂交得到二元母猪，二元母猪与杜洛克公猪杂交得到三元猪)：年龄为6～7月，性别为母猪或阉割后公猪，室内饲养温度为16～18 ℃，湿度为55%～65%，体重约为110 kg。宰杀时间分别为8月份(室外平均温度28～35 ℃)和12月份(室外平均温度5～12 ℃)。每个季节选择3头猪的猪皮。

胰蛋白酶(酶活力：16 376 U/mg)，美国Promega公司；异丙醇、NaOH(均为分析纯)，西陇科学股份有限公司。

1.1.2 仪器设备

FA1104 N型电子分析天平，上海丙林电子科技有限公司；DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；LGJ-1D-80型冷冻干燥机，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；TA-XT plus质构分析仪，英国Stable Micro System公司；Paar-Physica MCR 302型剪切应力控制流变仪，德国Anton Paar公司；Q-Exactive 质谱仪、EASY-nLCTM1000色谱系统，美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备

采用本课题组前期的制备方法[18]，将猪皮切成1 cm×1 cm的方形，清洗干净后加入异丙醇浸泡脱脂过夜。再按照料液比为1∶10(g∶mL)向猪皮中加入0.1 mol/L NaOH溶液，在15～20 ℃条件下搅拌反应2 h，每40 min更换1次NaOH溶液。然后将猪皮洗净至pH 7.0，按照料液比为1∶10(g∶mL)再加入0.2 mol/L HCl溶液，在15～20 ℃条件下搅拌反应4 h，每隔1 h更换1次HCl溶液。最后将猪皮洗净至pH 7.0。猪皮明胶的制备工艺为猪皮与超纯水的料液比为1∶3(g∶mL)，加热温度为55 ℃，提取时间为6 h。过滤除去猪皮残渣，将滤液冻干得到猪皮明胶，冷藏备用。

1.2.2 凝胶强度测试

使用TA-XT plus质构分析仪测定猪皮明胶的凝胶强度。将冻干后的明胶配制成质量浓度为6.67 mg/mL的明胶溶液，量取15 mL配制好的明胶溶液，置于4 ℃冷藏16～17 h至完全凝胶。用P/0.5R 探头测定冷藏后胶体的凝胶强度，探头测试速度为1 mm/s，将探头下压至胶体内部4 mm处时施加的力定义为胶体的凝胶强度[19]。

1.2.3 流变学测试

采用HUANG等[20]的方法，使用剪切应力流变仪的CC27转子测量明胶的流变特性(温度扫描、频率扫描)。

温度扫描：移取19 mL 6.67 mg/mL猪皮明胶溶液置于圆筒(CC27，MCR302)中，溶液先从40 ℃降温至5 ℃，再从5 ℃升温至40 ℃，速率均为0.5 ℃/min，应变力为0.5%, 频率为1 Hz。

频率扫描：对凝胶后的胶体进行频率测试，温度为5 ℃，应变力为0.5%，频率在0.01～10 Hz的线性黏弹范围内进行扫描。

1.2.4 样品酶解

将冻干后的样品溶解于SDT缓冲液(4 mg/mL十二烷基磺酸钠、100 mmol/L二硫苏糖醇、150 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl溶液)配制成1 μg/μL溶液，于沸水中加热3 min，室温冷却后加入200 μL 8 mol/L尿素裂解液并转入10 kDa超滤管，14 000×g离心30 min，弃下层滤液；再加入100 μL 100 mmol/L的碘乙酰胺溶液(含尿素裂解液)混匀1 min后放至暗处，静置20 min 后14 000×g离心15 min，接着再加入100 μL 8 mol/L尿素裂解液，继续14 000×g离心15 min，重复3次后弃下层滤液；向浓缩液中加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液后14 000×g离心30 min，此步骤重复3次；而后更换2 mL离心管。加入50 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液以及2 μg胰蛋白酶混匀1 min，37 ℃下反应20 h，反应完后离心收集滤液，即可得到酶解产物。

1.2.5 HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS

采用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS对酶解后产物进行分析。先使用纳升流速液相系统HPLC-EASY-nLC 1000 对其进行分离。流动相：A液[V(乙晴)∶V(甲酸)∶V(水)=2∶0.1∶97.9]，B液[V(乙晴)∶V(甲酸)∶V(水)=84∶0.1∶15.9]。色谱柱Thermo EASY column SC200 150 μm×100 mm (RP-C18)以100%的A液平衡。样品由自动进样器上样，再经色谱柱分离，流速为0.3 μL/min。流动相梯度如下表1所示，酶解产物经高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。分析时长：60 min，母离子扫描范围(m/z)：300～1 800，多肽和多肽的碎片的质荷比按照下列方法采集：MS在m/z200时分辨率为70 000，动态排除时间：40.0 s；每次全扫描后采集20个碎片图谱，MS/MS 在m/z200时分辨率为17 500，裂解类型：HCD，归一化碰撞能量：30 eV，底部填充率：0.1%。

表1 液相梯度设置Table 1 Liquid gradient settings

1.3 数据分析

使用MASCOT 2.2针对猪胶原蛋白检索MS/MS质谱。检索参数：固定修饰为半胱氨酸碘乙酰胺化；可变修饰：氧化(P，K和M)；最大未酶切位点为2；一级质谱错误率为±20 ppm；二级质谱错误率为±0.1 Da；当Mascot分数>40时，多肽峰被认定为阳性鉴定或准确度极高(P<0.05)[21]。

2 结果与分析

2.1 凝胶强度

凝胶强度是评价明胶质量的重要指标之一，冬夏两季猪皮明胶的凝胶强度如表2所示。随着季节平均温度的升高，明胶的凝胶强度由(811.0±0.6) g增加到(877.1±0.6) g，说明不同季节对猪皮明胶凝胶强度有着显著影响。这与段蕊等[22]的结果类似，原因在于明胶分子链越长，网格结构越紧密，凝胶强度越大，且冬季的胶原蛋白稳定性低于夏季，在明胶提取过程中，冬季胶原蛋白较夏季更易断裂成小分子链，易导致冬季明胶的凝胶网格结构松散，呈现较低的凝胶强度。

表2 冬夏猪皮明胶凝胶强度Table 2 Gel strength of winter and summer pigskin gelatin

2.2 流变学分析

2.2.1 温度扫描

当材料形变时，由弹性形变而存储在材料中的能量指标称为G′，而损失的能量指标称为G″[5]。在加热和冷却期间，在不同季节提取的猪皮明胶中G′和G″的变化如图1所示。冬夏季节猪皮明胶的凝胶和融胶过程中G′和G″的变化趋势基本相同，均是随着温度降低而升高，随着温度升高而降低。当温度逐渐升高时，猪皮明胶逐渐变为液态，此时猪皮明胶的G′低于其G″，表明猪明胶分子是单链状态。当随着温度降低，G′和G″曲线变得更陡峭，尤其G′迅速增加，是由于在离子相互作用、氢键、范德华力、疏水作用等非共价键作用下明胶分子链发生从单链到三重螺旋的自组装转变的过程[19]。

在冷却和加热期间，G′和G″存在一个交点，并在该点处于平衡状态。此外，在冷却和加热曲线上的G′和G″的交叉点被定义为胶凝点和胶融点，此时对应的温度分别为胶凝温度和胶融温度。由表2可知，冬季和夏季明胶胶融温度分别为(26.7±0.7)、(27.9±0.6) ℃，胶凝温度分别为(18.3±0.0)、(19.6±1.2) ℃。明胶的胶融温度和胶凝温度均随着季节温度的升高而升高，这可能是由于季节温度的升高增加了胶原蛋白的稳定性，从而影响了明胶的凝胶特性[23]。

2.2.2 频率扫描

在凝胶上施加摆动力矩会导致胶体分子在该时刻移动。当摆动力矩的频率从低到高变化时，分子链的运动也相应地变化，并且可以测量其黏弹性能。G′反映了外力变化时系统分子形变的能量，G″则反映了分子链内或分子之间的外力引起的系统分子力变化所产生的能量损失。明胶的频率扫描可以表征其凝胶强度，如图1-e所示，冬夏两季猪皮明胶的G′随频率增加而增加，说明凝胶化仍在进行中。冬季猪皮提取的明胶显示出更低的G′，这与2.1中的凝胶强度结果相一致。原因可能是较低的环境温度降低了胶原蛋白的稳定性，导致明胶分子质量降低，从而使得内部的凝胶网络交联减少[23]。

tanδ值(G″/G′)可以进一步证实这一结果，tanδ值越低表明凝胶体系受外力影响时的能量损失越低，即tanδ值较低时，其凝胶会形成更牢固的凝胶网络。如图1-f所示，夏季猪皮明胶的tanδ均低于冬季猪皮明胶，表明夏季猪皮明胶能形成更稳定的凝胶结构。此外，冬夏两季猪皮明胶的tanδ均呈现先降低后升高的趋势，且tanδ值均小于0.1，说明2种明胶均能获得了良好的凝胶网络或更接近固体的性质。但随着频率的逐渐增大，tanδ值逐渐增加，表明高频率扫描会逐渐破坏胶体的内部网络结构[24]。

a-降温过程中猪皮明胶G′；b-降温过程中猪皮明胶G″；c-升温过程中猪皮明胶G′；d-升温过程中猪皮明胶G″；e-频率扫描过程中猪皮明胶G′；f-频率扫描过程中猪皮明胶的tanδ值图1 冬夏季节猪皮明胶的流变学特性Fig.1 The rheological properties of pigskin gelatin in winter and summer

2.3 质谱鉴定特征多肽

2.3.1 猪明胶理论特征多肽

本课题组前期通过比对猪牛明胶序列，建立了猪、牛明胶理论特征多肽数据库[25]，通过数据库查询可知，猪明胶具有69种理论上的特征性多肽，其中包含27条源自α1链的特征多肽和42条源自α2链的特征多肽。因此可通过这些特征多肽序列溯源猪明胶。

2.3.2 冬夏两季猪皮明胶的特征多肽总体分析

本研究利用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS鉴定不同季节猪皮明胶的特征多肽。质谱数据分析的结果表明，夏季猪皮明胶包含80条特征多肽，冬季猪皮明胶包含66条特征多肽。夏季猪皮明胶特征多肽数量明显高于冬季猪皮明胶，这可能是由于夏季猪皮胶原蛋白结构稳定性强，其多肽序列在提取过程中能够更好地被保留，具有更多的酶切位点，被胰蛋白酶酶切之后释放出更多的特征多肽。将冬夏季猪皮明胶特征多肽进行对比，发现夏季猪皮明胶含有36条特有的特征多肽，冬季猪皮明胶含有22条，同时有44条特征多肽不会随季节变化而改变。为了进一步比较不同季节对明胶序列断裂位置的影响，不考虑修饰情况，以断裂位点为横坐标，比较冬夏季节特征多肽的分布情况。由图2可知，夏季明胶较冬季明胶添加了4个序列段，α1链和α2链各2个，亦说明夏季胶原蛋白有着更好的稳定性，在提取过程中保存更多的多肽序列，对明胶的溯源有一定帮助。

a-猪明胶α1链；b-猪明胶α2链图2 冬夏猪皮明胶特征多肽序列的分布Fig.2 Distribution of characteristic peptide sequences of winter and summer pigskin gelatin

2.3.2.1 冬夏两季猪皮明胶的非共有特征多肽

为说明不同季节对猪皮明胶特征多肽的影响，将来自不同季节猪皮的2个明胶样品中相同的特征多肽定义为共有特征多肽，将2个明胶样品中不同的特征多肽定义为非共有特征多肽。利用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS分别对冬夏季节猪皮中提取的猪皮明胶进行检测。结果如表3和表4所示，冬夏季猪皮明胶非共有特征多肽数分别为22和36，其中未修饰特征多肽数分别为2和3。冬夏季节猪皮明胶的2种未修饰的非共有特征多肽的串联质谱图如图3所示，冬季猪皮明胶中鉴定出m/z为1 037.011 62+的920GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR943(图3-a)及夏季猪皮明胶中鉴定出的m/z为486.231 42+的942QGPSGPSGER951(图3-b)的峰。2种特征多肽的质量与理论质量非常匹配，MS/MS产生的一系列y和b离子都显示这2种特征性胰蛋白酶肽的序列的准确性。不论是否带有修饰，这些非共有特征多肽只能在冬季或夏季猪皮明胶中单独被找到，即随着季节变化而改变，因此不能作为猪皮明胶溯源的特征多肽。

表3 冬季猪皮明胶非共有特征多肽Table 3 Non-common characteristic peptides of winter pigskin gelatin

表4 夏季猪皮明胶非共有特征多肽Table 4 Non-common characteristic peptides of summer pigskin gelatin

续表4

a-猪皮明胶α1链920GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR943；b-猪皮明胶α1链942QGPSGPSGER951图3 串联质谱鉴定的猪皮明胶特征多肽Fig.3 Porcine skin gelatin characteristic peptides identified by tandem mass spectrometry

2.3.2.2 冬夏两季猪皮明胶的共有特征多肽

2种猪皮明胶中的44条共有特征多肽(9条源自α1链和35条源自α2链)如表5所示，这些共有特征多肽不会随季节的变化而改变，可作为特征多肽用于猪皮明胶的溯源。由表5可知，这些共有特征多肽序列共有2种形式：第1种形式为未修饰的特征多肽序列，包括174SAGISVPGPMGPSGPR189、1052GETGPAGPAGPVGPVGAR1069、85G VGAGPGPMGLMGPR99、424GPTGPAGVR432和1068TGQPGA VGPAGIR1080；第2种形式为包含羟基化修饰的特征多肽序列。胶原蛋白脯氨酸羟基化以及胶原蛋白的部分水解会产生的大量羟脯氨酸[26-27]。因而存在序列相同但修饰不同的特征多肽片段，其复杂的修饰情况使序列识别更加困难，如不同数目的羟基化修饰位点和相同的修饰数目但不同的修饰位置。

图4为冬夏猪皮明胶的3个共有特征多肽的二级质谱图。3个特征多肽的氨基酸序列相同，但具有不同的羟基化修饰位点。m/z值分别为719.374 32+(图4-a)、727.375 12+(图4-b)和735.373 72+(图4-c)的3个峰均来自猪皮明胶α2链，分别具有1、2和3个脯氨酸羟基化位点。这3种共有特征多肽的质量与理论值(1 469.738 3、1 453.743 4和1 437.748 5)很好地匹配。MS/MS产生的一系列y和b离子准确地证明了这3个共有特征多肽均来自同一序列。

值得注意的是，通过一级质谱和串联质谱鉴定出的胰蛋白酶肽序列中可以检测到具有不同电荷(+1、+2、+3，+4和+5)的片段，其中+2和+3最常出现。在表5中，出于均一性考虑，列出的特征多肽的价态均为+2和+3。从理论上讲，各种电荷的质谱峰均可用于鉴定和分析蛋白质。

表5 冬夏季节猪皮明胶共有特征多肽Table 5 Common peptides of pigskin gelatin in winter and summer

a-猪皮明胶的α2链中的特征多肽574GIPGEFGLP*GPAGPR588(Pro582被羟基化)；b-特征多肽574GIP*GEFGLP*GPAGPR588(Pro576和Pro582被羟基化)；c-特征多肽574GIP*GEFGLP*GP*AGPR588Pro576, Pro582和Pro584被羟基化)图4 通过串联质谱法鉴定特征多肽的不同修饰水平Fig.4 Identification of different modification levels of characteristic peptides by tandem mass spectrometry

3 结论

综上所述，不同季节对猪皮明胶的凝胶特性有显著影响，当夏季转变为冬季时，猪明胶的凝胶强度由(877.1±0.6) g降低为(811.0±0.6) g；胶凝温度由(27.92±0.55) ℃降低为(26.7±0.7) ℃；胶融温度由(19.6±1.2) ℃降低为(18.3±0.0) ℃，表明猪皮明胶随着季节温度的降低而有所降低，易断裂为小分子链，导致冬季明胶凝胶特性较差。进一步运用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS，从冬夏两季猪皮提取的猪皮明胶中分别鉴定出了66和80个特征多肽，其中包含有44种共有特征多肽序列，不会随着季节的变化而改变，这些共有的特征多肽序列可以作为猪皮明胶溯源的依据。流变学、质构分析和质谱结果均表明，季节的变化会影响猪皮明胶的流变学特性和溯源性，所以猪皮明胶的溯源应优先考虑那些具有稳定性的共有特征多肽。同时，还应考虑其他外界因素可能会干扰识别，例如饲养方式和条件。后期需要进一步研究不同外界因素对明胶溯源性的影响，以提高猪皮明胶溯源的准确性。