奶牛乳房炎葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验

李潇 陈娟 何菊 周继国 罗元宇 程方俊

1.贵州省盘州市动物防疫监测服务站 553537

2.贵州省六盘水市农业科学院 553600

3.贵州省六盘水市水城区动物疫病预防控制中心 553600

4.贵州省威宁县农业农村局 553100

5.西南大学 402460

奶牛乳房炎是由物理，化学或微生物等因素刺激侵入奶牛乳腺所引发的一种炎症反应，其发病率比较高，表现为奶牛产奶量下降，发情期延长，繁殖性能降低。而葡萄球菌是引起奶牛乳房炎主要的细菌之一，该菌在食物中被人摄入后，可引起食物中毒。

本研究是对荣昌区不同奶牛场的78 份奶牛中检测有乳房炎的27 份牛奶乳样进行细菌分离，并检测细菌对抗菌药物的敏感性，筛选出针对葡萄球菌的敏感药物，从而为奶牛乳房炎的防治，临床指导及葡萄球菌的耐药性研究，提供理论依据。

1 材料

普通琼脂培养基；兔血；高盐琼脂培养基；LB 营养肉汤；革兰氏染色液；各类抗生素药物药敏纸片；细菌生化管；细菌基因组DNA 提取试剂盒；PCR 扩增反应试剂盒（宝生物工程有限公司）；DNA 胶回收试剂盒；DNA Marke；16S rRNA 基因引物（由武汉金开瑞有限公司合成）。

立式压力蒸汽灭菌锅、电泳仪、梯度PCR仪、冷冻离心机、双人单面净化工作台、接种环、显微镜和移液枪等。

2 方法

随机采取荣昌区几个奶牛场的泌乳奶牛乳样78 份。采集乳样之前先用温水来清洗乳房，并消毒乳头及和周围部分。收集样品时，弃掉前三把奶、后取10mL 左右的乳样挤入灭菌好的试管中，标记好试管，并详细记录。

进行CMT 试验来判断患有隐性乳房炎的情况，按照农业部所制定的《奶牛乳房炎防治技术指南（试行）》进行诊断。

吸取每个乳样的100ul,倾注于兔鲜血平板和LB 固体平板上，37℃温箱培养24h 后，观察菌落形态，挑起可疑单个菌落少许进行下一步纯化后革兰氏染色，镜检,当出现蓝紫色葡萄串珠状的细菌初步怀疑为葡萄球菌。

将分离菌株分别进行凝固酶试验、溶血作用、产生色素、发酵木糖、发酵甘露醇、碱性磷酸酶、发酵麦芽糖相关试验等，置于37℃恒温箱中培养24h～48h，观察并记录结果。具体步骤参照东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》进行。

提取葡萄球菌基因组DNA 进行PCR 扩增，以基因组DNA 为模板，反应引物为细菌16SrRNA 基因通用引物。PCR 扩增采用25µl 体系：PCR 酶12.5µl,灭菌双蒸水8.5µl，提取的基因组2.0µl,上游引物1µl，下游引物1µl。反应条件：94℃预变性10 min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸90s 经35 个循环；最后72℃延伸10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳后观察目的条带，结果照相保存；PCR 产物按照PCR 产物凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收，回收产物由公生物技术公司进行测序。

将培养好的葡萄球菌肉汤与0.5 号麦氏标准管浊度进行比浊后，用灭菌好的涂菌棒将20uL 葡萄球菌菌液均匀涂于整个平板表面。边涂边转动平皿重复3 次，使得接种细菌充分的分布在营养琼脂平板表面，放置1～2min,倒置放于37℃培养箱中培养24h 后用游标卡尺测量其纸片的抑菌直径。

3 结果

3.1 CMT 试验结果78 份乳样检测出有27 份患有隐性乳房炎，部分结果如图1。

图1 CMT 试验判定

3.2 形态学观察葡萄球菌在鲜血营养琼脂平板培养24h 后出现圆形或者椭圆形凸起、光滑、湿润、表皮葡萄球菌菌落乳白或灰白，实心圆葡萄串状，该菌以单，双葡萄状排列，不透明，直径约1.5～2mm（图2）；在高盐琼脂上菌落特征生长初期基本同血液琼脂平板,金黄色葡萄球菌出现黄玉米色（图3）；镜检结果显示，该菌为革兰氏阳性菌（图4）

图2

图3

图4

3.3 生化鉴定结果经生化鉴定R3 为金黄色葡萄球菌，R5为表皮葡萄球菌，R1 为溶血葡萄球，RC4 为腐生葡萄球菌。

3.4 电泳结果经16S rRNA 基因扩增，获得凝胶电泳片段与目的片段大小相符（图5）。PCR 产物经胶回收试剂盒纯化后，送至生物公司测序。

图5 PCR 扩增的16S rRNA 电泳结果

3.5 药敏试验结果根据2008 年美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的标准按敏感、中介、耐药三级报告判定。结果显示该16 株分离菌对环丙沙星、诺氟沙星、多西环素、麦迪霉素和氧氟沙星等抗生素敏感性较高。

4 分析与讨论

该研究结果表明：一、用CMT 试验检测出荣昌区患有隐性乳房炎奶牛的发病率为34.6%，发病率低于其他地区，这可能与荣昌奶牛养殖场近年来饲养管理水平提高有一定关系。二、检测的27 份患有乳房炎奶样中共鉴定出葡萄球菌有16 株，其金黄色葡萄球菌的检出率较低，可能是不同地区对奶牛乳房炎葡萄球菌的检出率不同。三、药敏试验结果显示：检出的葡萄球菌对环丙沙星、诺氟沙星、多西环素、麦迪霉素和氧氟沙星高度敏感，敏感率均在88%以上，对青霉素和多粘菌素B 耐药。通过这次的研究结果可以为该地区奶牛乳房炎进行治疗并提供参考依据。