利用剪切波弹性成像技术评价大鼠非酒精性脂肪性肝病严重程度

周琴，吕国荣，，郭海欣，李靖云，张少波，陈永健

1.福建医科大学附属第二医院超声科，福建泉州362000；2.泉州医学高等专科学校临床医学院，福建泉州362000；3.晋江市安海医院超声科，福建泉州362000

前言

剪切波弹性成像（Shear Wave Elastography，SWE）能实时定量检测肝脏硬度，但目前利用SWE评估非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis,NASH）及其相关肝硬化的研究较少［1］。有研究表明非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD）伴随的多种生物分子改变可能会影响剪切波传播［2］，但有关SWE 与NAFLD 相关分子改变的相关性鲜有报道。因此，本实验利用SWE 研究NAFLD大鼠肝脏硬度的改变并进一步明确影响剪切波在NAFLD 肝脏传播的相关生物分子，旨在为临床无创性评估NASH及肝硬化提供参考。

1 资料与方法

1.1 实验动物及模型制备

选取雄性SD 大鼠88 只，质量250～270 g。随机选择40 只作为对照组，其余为实验组。实验组按喂养方式不同随机分为6 个亚组，每个亚组8 只（图1）。高脂饲料（High-Fat Diet, HFD）：2%胆固醇+15%猪油+5%蛋黄粉+0.5%胆盐+2%白糖+75.5%普通基础颗粒饲料；动物和HFD 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供；蛋氨酸/胆碱缺乏饲料（Methionine-Choline Deficient Diet,MCDD）由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。其中，40%四氯化碳（CCl4）溶液（CCl4：橄榄油=2：3），剂量为1.5 mL/kg，每周两次。

图1 实验动物分组及模型制备Fig.1 Experimental animals grouping and model preparation

1.2 仪器和方法

采用法国声科SuperSonic Imagine AixPlorer 型实时剪切波弹性成像超声诊断仪，线阵探头，频率4～15 MHz。

（1）肝脏超声检查：分别于第1、2、3、8、12周末随机抽取8只正常组大鼠，与预定喂养周期结束的实验组大鼠进行检测。检查前所有实验动物禁食12 h，禁水6 h。麻醉后肝区备皮，探头轻置于大鼠腹部，先行常规超声检查并统一选取肝中叶启用SWE 模式，尽量避开肝脏大血管、胆道和叶间裂的区域，于距离体表1.0 cm 处选择感兴趣区域（Region of Interest,ROI），ROI设定为直径约2 mm 的圆形，开启Q-BOX测量ROI的杨氏模量值，测量5次，取平均值，得到杨氏模量平均值Emean。

（2）病理学检查及mRNA 检测：超声检查完成后，解剖肝脏，取肝中叶（即SWE 检查部位）固定于10%中性福尔马林并包埋在石蜡中，切片行HE 染色、Masson 染色，光镜下观察肝脏组织学改变。另取一部分肝组织在液氮中快速冻存。总RNA的提取依照Trizol（Invitrogen）的说明书进行。反转录依照试剂盒说明书进行。大鼠b-actin 作为内参照，设计引物（表1）。利用RT-PCR 技术对样品进行检测，读取荧光值。使用2-ΔΔCT方法计算样本目标基因的相对含量。

表1 RT-PCR的引物信息Tab.1 Primer information for RT-PCR

1.3 判断标准

参考Kleiner 等［3］的方法，根据NAFLD 活动性评分（NAFLD Activity Score,NAS）及纤维化等级，将最终病理结果分为正常组（NAS=0,纤维化F0），单纯脂肪变性组（NAS=1～2,纤维化F0），边界组（NAS=3～4,纤维化F0），NASH 组（NAS≥5, 纤维化F0～F3），肝硬化组（纤维化F4）。

1.4 统计学分析

使用SPSS23.0 统计学软件包对数据进行分析，计量资料用均数±标准差表示。多组均数比较采用单因素方差分析，相关分析采用Spearman 相关分析法。应用多元线性回归模型对多种影响因素进行显著性分析。以病理分级为金标准，利用接受者操作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线建立NASH 及肝硬化的杨氏模量界值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理结果

对照组切片显示所有大鼠肝脏均未发生病变；HFD-1W组中2只可纳入正常组，4只纳入单纯脂肪变性组，2只纳入边界组；MCDD-2W组中单纯脂肪变性组和边界组各1只，余6只纳入NASH组；HFD-3W组中2只纳入边界组，6只纳入NASH组；MCDD-8W组和MCDD-12W组的所有大鼠均纳入NASH组；MCDD-12W/CCl4组中2只评为NASH，6只具有肝硬化改变。

光镜下正常组的肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉为中心，呈放射状排列，门管区未见炎性细胞浸润，肝细胞内无明显脂肪空泡，未见纤维间隔形成。随着病程进展，实验组逐渐出现不同程度的肝细胞肿胀，胞浆内可见大小不等的脂肪空泡，部分肝细胞呈气球样变，小叶内可见炎症、坏死；严重者为肝索排列紊乱，肝窦间隙变窄，纤维间隔形成，可见假小叶形成（图2）。

2.2 Emean与病理结果的相关性

所有大鼠肝脏Emean与NAFLD 严重程度呈显著正相关（r=0.838,P＜0.001）。NAFLD 不同病理分组间的Emean差异有统计学意义（F=113.58,P＜0.001）。NASH 组和肝硬化组Emean显著高于正常组、单纯性脂肪变性和临界组（P＜0.001）。肝硬化组的Emean显著高于NASH 组（P＜0.001）。在正常组、单纯性脂肪变性组和临界组之间，Emean没有显著差异（P＞0.05）。SWE测量见表2和图2。

图2 实验组大鼠肝脏病理表现及SWE测量Fig.2 Pathological manifestations and SWE measurement of rat liver in experimental groups

2.3 Emean与mRNA表达水平的相关性

MCP-1（r=0.678,P＜0.001）、TNF- α（r=0.340,P=0.001）、I型胶原（r=0.402,P＜0.001）、α-SMA（r=0.561,P＜0.001）均与Emean呈正相关；且多元线性回归分析显示，MCP-1（B=0.560,P＜0.001）和I型胶原（B=0.429,P＜0.001）与Emean呈独立相关。不同病理分组的Emean和mRNA表达水平见表2。

表2 不同病理分组的Emean和mRNA表达Tab.2 Emean and mRNA expression in different pathological groups

2.4 ROC曲线分析

SWE 诊断NASH、肝硬化的截值分别为6.0 kPa、9.7 kPa，曲线下面积分别为0.95、0.98，敏感性分别为88.9%、86.5%，特异性分别为100%、92.7%，见图3。

图3 SWE对大鼠NASH和肝硬化的诊断效能Fig.3 Diagnostic efficacy of SWE in NASH and liver cirrhosis

3 讨论

NAFLD 的发病率逐年升高，已成为全球最常见的慢性肝病［4］。其疾病谱包括单纯性脂肪变性、NASH、肝纤维化和肝硬化［5］。其中，NASH与肝纤维化密切相关，它是肝硬化和肝癌的显著危险因素，在NASH相关的肝硬化患者中，肝癌的发病率至少为每年1%～2%［6］。目前，肝穿刺活检仍是确诊NASH 及肝硬化的金标准［7］，但其有创性和潜在的并发症限制了其在临床中的应用［8］。因此，寻找能够早期、无创识别NASH及肝硬化的非侵入性检测手段尤为重要。

超声弹性成像技术是一种可对组织硬度进行检测和评估的新型超声诊断技术［9］。其中，SWE是目前最新应用于临床的一种弹性成像技术。其原理是通过发射高速聚焦的声辐射力脉冲在纵向不同深度上连续聚焦，使不同深度的组织几乎同时产生横向位移，通过“马赫锥”原理，在聚焦部位而产生剪切波，随后应用颜色编码技术实时显示组织弹性图［10］。本研究通过检测实验动物的Emean得出肝脏Emean，提示诊断NASH的最佳临界点，即当Emean≥6.0 kPa时，必须高度警惕NASH的可能性。Kang等［11］将NASH的Emean截值定为5.9 kPa，本实验结果与之相近。此外，本实验认为，肝硬化的最佳截值可定为9.7 kPa，该结果与Deffieux等［12］提出的截值接近。

国内外有众多研究报道了SWE在评估慢性肝炎患者肝纤维化方面的高诊断性能［13-15］，但对评估NAFLD方面尚未得到充分验证，且NAFLD脂肪变性程度对肝脏硬度是否产生影响仍存在争议。Petta等［16］研究结果提示脂肪变性程度是肝脏硬度增高的独立预测因子（P=0.03）；Guo等［17］认为在不同严重程度的脂肪变性间肝脏硬度并未观察到明显的差异，即脂肪变性不影响肝脏硬度值；Rifai等［18］研究发现肝脏硬度与肝纤维化分级（P＜0.001）和炎症活性（P＜0.05）相关，但肝脏脂肪变性对肝脏硬度的影响没有统计学意义（P＞0.05）。本研究在对NAFLD大鼠肝脏病理改变进行分析时发现，NASH组和肝硬化组的肝脏硬度显著高于正常、单纯性脂肪变性和临界组（P＜0.001），肝硬化组的肝脏硬度也显著高于NASH组（P＜0.001），而正常组、单纯性脂肪变性组和临界组之间，肝脏硬度没有显著差异（P＞0.05）。由此推测，肝脏硬度可能与纤维化程度相关，而与脂肪变性无关。NAFLD初期，肝脏还未出现纤维化，肝脏硬度未发生明显变化，随着NAFLD发展，纤维化程度逐渐加重，肝脏硬度和病变程度呈正相关。

NAFLD 伴随着许多生物分子变化，包括促炎和纤维化细胞因子的激活。据报道，MCP-1、TNF-α、I型胶原、α-SMA 的mRNA水平与NAFLD 的发病机制密切相关［19］。这些改变可能会影响超声波和剪切波传播，但对其影响较大的分子生物学指标是哪些仍未知［20］。本研究发现，虽然MCP-1、TNF-α、I型胶原和α-SMA 这4 种mRNA 的表达均与NAFLD 严重程度呈正相关，但MCP-1 和I型胶原的mRNA 表达与Emean呈独立相关（P＜0.001）。MCP-1可趋化巨噬细胞进而引起肝脏炎症浸润，并激活肝星状细胞导致I型胶原大量堆积，炎症反应和I型胶原沉积都促进了肝纤维化的发生发展［21］。由此推测，MCP-1 和I型胶原可能通过诱导肝纤维化进展从而影响剪切波传播。