过氧亚硝酸根荧光探针的构建及细胞成像应用

张洪星，刘景，郭炜

（山西大学 化学化工学院，山西 太原030006）

0 引言

过氧亚硝酸根（ONOOˉ）是一种内源性的高活性氧化物，由一氧化氮自由基（NO·）和超氧自由基（O2•ˉ）通过扩散反应生成（k=6.7×109（mol/L）ˉ1·sˉ1）［1］，在细胞中主要产生于线粒体和吞噬体［2］。在正常的生理条件下，ONOOˉ虽然具有低的稳态浓度（～纳摩尔）和极短的寿命（～10 ms），却发挥着重要的生理功能。例如，ONOOˉ不仅可以通过硝化络氨酸残基起到信号传导的作用、可以对入侵的病原体起到免疫作用、可以保护神经元免于凋亡，而且在维持细胞内氧化还原平衡方面起着至关重要的作用；然而，ONOOˉ过量产生可以氧化和/或硝化一系列生物分子，例如蛋白质、核酸、脂质、核酸、络氨酸残基和生物硫醇等［3］，严重影响细胞正常的生理活动，甚至引起细胞凋亡和坏死。长期的ONOOˉ压力还会引发多种疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病、自身免疫性疾病和癌症等［4］。因此，开发特异性的ONOOˉ荧光探针具有重要的生理学和病理学意义。

近年来，用来检测ONOOˉ的方法多种多样，主要有电化学分析法、电子顺磁共振法、高压液相色谱法、化学发光法、紫外可见分光光度法［5-8］等，但是这些技术普遍存在一些缺陷，如灵敏度低、侵入性、设备昂贵、操作费时等。鉴于高敏感性、可视化、生物兼容性、无辐射、实时检测等特点，荧光探针技术已经是生物学、医学领域不可或缺的研究手段，到目前为止，已经开发了大量的ONOOˉ荧光探针用于体外或体内ONOOˉ的检测。罗丹明或荧光素的还原产物是早期报道的ONOOˉ荧光探针，这类探针的发射波长通常位于可见区，且容易受到其他活性氧的干扰［9-11］。随着人们对ONOOˉ结构及性能的深入了解，一系列高选择性ONOOˉ荧光探针也陆续被报道，从反应位点分析，这些探针主要可分为 三 氟 甲 基 酮 型［12］、α-酮 酰 胺 型［13-14］、硼 酸 酯型［15-16］、有机硒/碲型［17］、酰肼型［18-19］、对羟基苯胺型［20-22］、C=C 双键裂解型［23］、二苯基膦型［24-25］等。上述研究成果对于人们更好地理解ONOOˉ的生理功能以及与ONOOˉ的相关疾病有极大的帮助。然而，上述大部分探针仍存在由于水溶性差导致的生物兼容性差、发射波长短（＜600 nm）、灵敏性低、易受其他活性氧化物（Reactive oxygen species，ROS）干扰的问题，因此大多不适用于生物系统中ONOOˉ检测。发射波长位于红及近红外区（＞600 nm）的荧光探针因具有更深的组织成像深度、小的光损伤以及受生物自发荧光干扰小的特点，因此在组织、活体荧光影像时具有比可见区荧光染料更高的时空分辨率。此外，鉴于ONOOˉ活泼的化学性质、短的寿命和低的稳态浓度，如何避免生物体内其他活性氧，尤其是次氯酸根（hypochlorite，ClOˉ）、羟基自由基（hydroxyl radical，HO·）和过氧化氢（hy⁃drogen peroxide，H2O2）的干扰，仍然是该领域的重要挑战。

罗丹明类荧光染料由于具有荧光量子产率高、生物兼容性好、细胞器靶向性好以及发射波长易于调控等优点，是荧光探针领域备受青睐的染料平台之一。其中，吡罗红染料因包含了罗丹明染料的母体结构，因此具有与其类似的光物理性质；除此之外，该染料的荧光性质不仅易受光诱导的电子转移（photoinduced electron transfer，PET）荧光调控机理所调控，而且当该染料的9-位被不同取代基取代后，光物理性质会发生明显的变化：供电子基团能导致发射波长蓝移，吸电子基团或硫醇官能团能导致发射波长红移。吡咯是天然五元杂环芳香化合物，具有较大的电子云密度，因此极易被氧化剂氧化。此外，与PET 机理中经典的单原子供体（如O，N，Se，Te 等）相比，更富电子的吡咯结构将会通过“增强的PET（Enhanced PET）”过程更有效的猝灭荧光团的荧光，从而实现低背景和高信噪比［26］。本工作基于“9-氯吡罗红”平台，将2，4-二甲基吡咯反应位点直接与吡罗红染料的9 号位连接，合成了一个“2，4-二甲基吡咯-吡罗红”荧光探针PyP（图1）。由于从富电子的2，4-二甲基吡咯基团到吡罗红“增强的PET”作用，探针PyP 具有极低的背景荧光；与ONOOˉ作用后，探针在624 nm 处的荧光强度增强128 倍，对ONOOˉ的检出限为2.3 nmol/L。此外，该探针具有优良的水溶性和生物兼容性，可以用于Raw264.3 细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）中外源性及内源性ONOOˉ的传感。

图1 探针PyP 与ONOOˉ响应机理示意图Fig. 1 Proposed ONOOˉsensing mechanism of PyP

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

吡罗红B、2，4-二甲基吡咯、草酰氯购于北京伊诺凯科技有限公司，细胞计数试剂盒（CCK8）购于北京索莱宝科技有限公司，NOC-9、SIN-1 购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，其他常用试剂购于阿拉丁试剂有限公司，上述所有原料均为市售分析纯或化学纯，如无特殊说明则没有进一步提纯；实验用到的溶剂购于当地经销商，溶剂使用前均按照标准进行干燥处理；所有反应经磁力搅拌进行，反应过程用薄层色谱（TLC）监测，反应产物用柱色谱分离提纯。紫外-可见吸收光谱图在紫外-可见分光光度计（Varian Carry 4000，日本）上测定；荧光光谱图在荧光光谱仪（Hitachi F-7000，日本）上测定；核磁共振氢谱和碳谱（1H NMR 和13C NMR）在核磁共振氢谱仪（Bruker AVANCE III HD，瑞士）上测定，其中，氢谱为600 MHz，碳谱为150 MHz；高分辨质谱图在质谱仪（Varian QFTESI，德国）上测定；细胞成像数据在共聚焦显微镜（Ceiss LMS 710，德国）上测定。

1.2 探针的合成及表征

1.2.1 化合物2的合成

将 化 合 物1（0.358 g，1.0 mmol）和KCN（0.195 g，3.0 mmol）溶解在10 mL 水中，反应液加热回流18 h 后冷至室温，过滤得固体，将固体溶解在2.0 mol/L 的HCl 中（100 mL），然后逐滴 加入FeCl3·6H2O（0.807 g，3.0 mmol）的HCl 溶 液 中（2.0 mol/L，10 mL），反应液在90 ℃时反应12 h 后冷至室温，过滤得固体，将固体溶解在50 mL 的NaHCO3饱和溶液中回流反应3 d，反应结束后冷却至室温，过滤得粗品。粗产品经柱色谱（CH2Cl2/MeOH，50：1V/V）分离得亮黄色固体（0.134 g，产率39.7%）。1H NMR（600 Hz，CDCl3）δ8.10（d，J= 9.0 Hz，2H），6.65（dd，J1= 1.8 Hz，J2= 9.0 Hz，2H），6.69（s，2H），3.46（q，J=7.2 Hz，8H），1.25（t，J= 7.2 Hz，12H）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ177.099，161.402，154.921，130.754，114.531，111.513，99.266，47.652，15.459；ESIMS：［M+H］ + calcd for 339.2066，Found 339.2067。

1.2.2 探针PyP的合成

在N2 保护下，将氧杂蒽酮2（0.338 g，1 mmol）溶解在干燥的CH3CN（10 mL）中，向上述溶液中逐滴滴入草酰氯（73 μL），室温反应2 h 后在旋转蒸发仪上蒸干溶剂，得到的中间体无须提纯，直接用于下一步反应中。将2，4-二甲基吡咯（0.475 g，5 mmol）和上述中间体（0.196 g，0.5 mmol）溶解在CH2Cl2（10 mL）中，室温反应5 min 后，蒸干溶剂，粗产品经柱色谱（CH2Cl2/MeOH=15/1）分离得到化合物PyP（0.22 g，产率97.6%），合成路线见图2。

图2 探针PyP 的合成路线Fig. 2 Synthetic route of probe PyP

1H NMR（600 Hz，CDCl3）δ12.47（s，1H），7.95（dd，J1= 1.8 Hz，J2= 9.0 Hz，2H），6.89（d，J=9.6 Hz，2H），6.59（s，2H），6.05（s，1H），3.56（q，J= 7.2 Hz，8H），2.56（s，3H），2.05（s，3H），1.30（t，J= 7.2 Hz，12H）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ173.9，160.6，157.2，151.8，142.6，137.9，131.1，123.5，115.7，115.5，98.7，48.4，17.1，16.5，16.3，15.5；ESI-MS：［M+H］+ calcd for 416.2696，Found 416.2697。

1.3 待测物的配置

探针PyP 用乙腈配成2 mmol/L 的储存液；GSH用蒸馏水配成20 mmol/L的储存液；O2⋅-溶液是将KO2和18-Crown-6（1 当量）溶于二甲基亚砜（DMSO）中制得；HO·是通过Fenton 反应（Fe2++H2O2）制得，其浓度等于Fe2+浓度；1O2溶液是通过次氯酸钠溶液（NaOCl）与双氧水溶液（H2O2）的反应制得，其浓度等于NaOCl 浓度；NO 是将商业化NO 供体NOC-9 溶解于0.1 mol/L 的NaOH 中制得；H2O2溶液通过稀释市售的过氧化氢制得，其浓度由240 nm处的吸光度值计算确定（摩尔消光系数为43.6（mol/L）ˉ1·cmˉ1）；ClOˉ溶液通过稀释市售的NaClO制得，其浓度由292 nm处吸光度值计算确定（摩尔消光系数为350（mol/L）ˉ1·cmˉ1）；ONOOˉ根据文献中报道的方法制得［27］，其浓度由302 nm 处吸光度值计算确定（摩尔消光系数为1 670（mol/L）ˉ1·cmˉ1），进行细胞实验时，ONOOˉ是由商业化ONOOˉ供体SIN-1 溶解于0.1 mol/L 的NaOH 中产生。

1.4 细胞成像实验

Raw264.7 细胞购于通派（上海）生物科技有限公司。将Raw264.7 细胞培养在含有10%胎牛血清（FBS）及1%抗生素的1 640 培养液中，将细胞按照1×105 个/孔的密度铺在共聚焦玻底皿中（直径=30 mm），待细胞贴壁后备用。在影像内源性ONOOˉ的实验中，细胞需预先用包含或不包含抑制 剂（AG、TEMPO 和FeTMPyP）的LPS（1 mg·mLˉ1）和IFN-γ（50 ng·mLˉ1）处理6 h，然后再孵化探针PyP（2 μmol/L）15 min；在影像外源性ONOOˉ的实验中，细胞需用PyP（2 μmol/L，15 min）处理，再用SIN-1（1 mmol/L，30 min）处理，细胞用PBS洗涤3 次，成像。激发波长为561 nm；发射收集波长为570 nm～750 nm。

1.5 细胞毒性实验

Hela 细胞购于通派（上海）生物科技有限公司。HeLa 细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）及1%抗生素的DMEM 培养液中，将细胞按照8×103/孔的密度铺在96 孔板中，待细胞贴壁后更换溶有2、4、6、8 和10 μmol/L 探针PyP 的新鲜培养基，每个浓度梯度重复6 次，细胞继续孵化24 h。细胞用PBS 洗涤3次后，更换含有10%CCK-8 的新鲜培养液，细胞继续孵化30 min。然后用酶标仪（SpectraMax 190）测量450 nm 处的OD 值。细胞存活率通过下述公式进行计算：细胞存活率=（Awithprobe-Ablank）×100%或（Acontrol-Ablank）×100%。

2 结果与讨论

2.1 探针的光物理性质

为了验证探针PyP 在PBS 中可以稳定存在，首先测试了探针在PBS 中的荧光光谱图，如图S1 所示，探针在PBS 中放置30 min 不会引起荧光信号的改变。接下来，验证探针PyP 对活性氧化物的传感性能，我们首先通过紫外-可见吸收光谱研究探针PyP 与代表性活性氧化物的响应情况。如图3（A）和图S2 所示，在PBS 缓冲体系中，探针的最大吸收峰值为558 nm，当向探针中逐渐加入10 当量常见的活 性 氧 化 物 后，包 括1O2，H2O2，ClOˉ，O2•ˉ，BO3ˉ，NO2ˉ，NOC-9，OH·和ONOOˉ，仅有ONOOˉ能引起探针PyP 吸收光谱的改变，即探针在558 nm 处的吸收峰消失，在580 nm 处出现了新的吸收峰。由于细胞内GSH 的浓度高达1 mmol/L～10 mmol/L，Cys 的浓度高达200 μmol/L，考虑到实际的活细胞应用，我们还测试了探针与GSH 和Cys 的反应性能，如 图S2（I，J）所 示，1 mmol/L 的GSH 和200 μmol/L 的Cys 均不会引起探针吸收光谱的改变。为进一步探究探针PyP 与ONOOˉ的反应历程，测试了其与不同浓度ONOOˉ的反应动力学，如图S3所示，随着ONOOˉ浓度的逐渐增加，探针在558 nm处的吸收峰逐渐下降，在580 nm 处的吸收峰逐渐增强，当ONOOˉ的浓度为20 μmol/L 时，探针达到了饱和，探针与ONOOˉ反应前后最大吸收峰红移了22 nm，说明探针与ONOOˉ的反应产物具有吸电子的诱导效应。荧光光谱如图3（B）和图S4 所示，由于从2，4-二甲基吡咯到吡罗红的PET 作用，探针几乎没有荧光，随着ONOOˉ浓度的逐渐增加，探针在624 nm 处出现了新的发射峰，且荧光强度随着ONOOˉ浓度的增加而增大，荧光强度增强128 倍，反应产物的红色荧光可在紫外灯照射下通过肉眼明显观测到（图3B 插图）。为了研究探针荧光强度与ONOOˉ浓度的线性关系，我们进行了荧光滴定实验并制作了工作曲线，如图3（C-D）所示，探针在624 nm 处的荧光强度与ONOOˉ的浓度（0 μmol/L～10 μmol/L）呈良好的线性关系，线性相关系数为0.999，探针对ONOOˉ的最低检出限（S/N=3）为2.3 nmol/L。鉴于细胞内低的ONOOˉ浓度，进一步研究了探针与小当量ONOOˉ的滴定实验，如图S5 所示，探针在624 nm 处的荧光强度与ONOOˉ的浓度（0 μmol/L～2 μmol/L）仍然呈良好的线性关系。

图3 探针PyP（2 μmol/L）与ONOOˉ（20 μmol/L）反应前后的紫外-可见吸收光谱图（A）及荧光光谱图（B）；（C）向探针PyP（2 μmol/L）中加入ONOOˉ（0 μmol/L～40 μmol/L）后的荧光光谱图；（D）PyP 对ONOOˉ的工作曲线Fig. 3 (A)Absorbance and(B)fluorescence spectra of PyP(2 μmol/L)upon addition with ONOOˉ(20 μmol/L);(C)Fluorescence spectra of probe PyP(2 μmol/L)in the presence of ONOOˉ(0-40 μmol/L);(D)A plot of F624 versus the concentration of ONOOˉin the range of 0-10 μmol/L

随后，研究了探针PyP（2 μmol/L）对ONOOˉ的荧光选择性及抗干扰能力。如图4 所示，向含有探 针 的PBS 体 系 中 加 入1O2，H2O2，ClOˉ，O2•ˉ，BO3ˉ，NO2ˉ，NOC-9，OH·，ONOOˉ，GSH 和Cys后，仅有ONOOˉ能引起624 nm 处荧光强度的显著增强。此外，我们在上述竞争物存在的条件下分别测试了探针对ONOOˉ的响应情况，如图S6 所示，探针能在各种竞争物存在下对ONOOˉ进行识别。最后，研究在不同pH 条件下探针PyP 与ONOOˉ的反应性能，结果显示，探针在2～12 的pH 范围内均显示可忽略的荧光，当加入20 μmol/L 的ONOOˉ后，探针在6～10 的pH 范围内观察到明显的荧光信号（图S7），说明探针可以在生理pH 范围内对ONOOˉ进行传感，这为探针的实际应用提供了可能。以上结果说明，探针PyP 可以在生理pH 条件下高选择性地传感ONOOˉ荧光探针。鉴于良好的水溶性，该探针有望在细胞水平实现对ONOOˉ的实时传感。

图4 探针PyP（2 μmol/L）与ONOOˉ及其他ROS、GSH 和Cys 反应1 min 后的荧光光谱图（A）及柱状图（B）。（1）只有PyP；（2）1O2；（3）H2O2；（4）ClOˉ；（5）O2ˉ；（6）BO3ˉ；（7）NO2ˉ；（8）NOC-9；（9）OH·；（10）GSH；（11）Cys；（12）ONOOˉ。激发波长为565 nm；发射波长为624 nm；狭缝为10/10 nm；电压为600 VFig. 4 Fluorescence spectra(A)and bar chart(B)of PyP(2 μmol/L)toward ONOOˉand other ROS(10 μmol/L)after 1 min. (1)PyP only;(2) 1O2;(3)H2O2;(4)ClOˉ;(5)O2ˉ;(6)BO3ˉ;(7)NO2ˉ;(8)NOC-9;(9)OH·;(10)GSH;(11)Cys;(12)ONOOˉ. λex/λem=565 nm/624 nm;Slits:10/10 nm;voltage:600 V

2.2 探针的响应机理研究

为了探究探针PyP 与ONOOˉ的反应机理，接下来我们模拟体外测试的条件，在PBS体系中进行了PyP与ONOOˉ的放大反应，并分离得到了反应产物。经薄层色谱监测反应液，我们发现PyP 与ONOOˉ的反应产物有两个，主要产物是具有红色荧光的物质，少量副产物是没有荧光的物质，二者的含量大约是3：1。为了验证其具体结构，将探针及其与ONOOˉ反应的两个产物进行了质谱分析。如图5 中质谱数据显示，探针PyP 本身的信号峰为m/z=416.267 6；红色荧光物质的信号峰为m/z=432.264 0，证实生成了羟基化产物PyP-OH；少量副产物的信号峰为m/z=461.252 3，证实生成了硝基化产物PyP-NO2，这与ONOOˉ共轭酸形式能分解为HO·和NO2·的情况一致（ONOOˉ⇌ONOOH ⇌HO·+NO2·）［28］。为进一步确定反应产物的结构，我们将探针及其与ONOOˉ反应的两个产物进行了核磁分析。如图6 所示，在氘代氯仿中，PyP 中吡咯结构上N-H 的化学位移在12.47 ppm，C-H 的化学位移在6.05 ppm；羟基化产物PyP-OH中吡咯结构上N-H的峰消失，这说明羟基化反应发生在探针的吡咯NH 位置；硝基化产物PyP-NO2中吡咯结构上C-H的峰消失，这说明硝基化反应发生在探针的吡咯环上。基于这些信息，我们推测探针PyP 与ONOOˉ的反应是单电子氧化机理。由于探针与ONOOˉ反应生成的产物为PyP-OH，为进一步验证OH·不会干扰PyP 对ONOOˉ的检测，我们进行了探针PyP 与OH·的滴定实验，如图S8 所示，随着OH·浓度的增加（20 μmol/L～250 μmol/L），探针PyP 在624 nm 处的发射峰仅有微弱的升高。考虑到细胞内具有极低的OH·浓度，因此OH·不会干扰探针对ONOOˉ的检测。

图5 探针PyP 及其与ONOOˉ反应产物的质谱图Fig. 5 Mass-spectroscopy analysis of PyP or the reaction products of PyP treated with ONOOˉ

图6 探针PyP 及其与ONOOˉ反应产物的氢谱结果Fig. 6 1H NMR analysis of PyP or the reaction products of PyP treated with ONOOˉ

2.3 活细胞荧光成像

进行活细胞成像之前，首先用CCK-8 试剂盒评价探针的细胞毒性。如图S9 所示，HeLa 细胞用不同浓度的PyP（0 μmol/L～10 μmol/L）处理24 h后，细胞存活率在60%左右，说明大浓度的探针会对细胞产生一定的毒性。然而，当选用2 μmol/L 的PyP 作为细胞影像的工作浓度时，细胞存活率大于90%，说明此浓度的探针适合生物成像研究。随后，选取Raw264.7 细胞作为发炎细胞模型，验证探针PyP 影像细胞中外源性及内源性ONOOˉ的能力，如图7（A，B）所示，当Raw264.7 细胞经PyP（2 μmol/L，15 min）处理后，细胞中呈现出可忽略的荧光信号；当Raw264.7 细胞先经PyP（2 μmol/L，15 min）处理，再经SIN-1（一种常见的ONOOˉ供体）处理后，细胞中可观察到明显的红色荧光信号，说明探针可以影像Raw264.7 细胞中外源性的ONOOˉ。此外，探针影像内生ONOOˉ的能力如图7（C-F）所示，Raw264.7 细胞先用脂多糖（LPS）和γ-干扰素（IFN-γ）处理6 h 刺激产生ROS 后，再孵化探针15 min，细胞内可观测到红色荧光信号；Raw264.7 细胞若先用包含ROS 清除剂（AG、TEMPO 和FeTMPyP）的脂多糖（LPS）和γ-干扰素（IFN-γ）处理6 h 后，再孵探针15 min，细胞内观察不到红色荧光信号的产生，说明该红色荧光信号是由ONOOˉ的产生引起的。由此可知，探针PyP不仅具有低的细胞毒性、好的亲水亲油性及良好的细胞渗透能力，而且可以影像巨噬细胞中外源性及内源性的ONOOˉ。

图7 RAW264.7 细胞的细胞成像图。（A）细胞用PyP（2 μmol/L，15 min）处理后影像；（B）细胞先用PyP（2 μmol/L，15 min）处理，再用SIN-1（1 mmol/L，30 min）处理后影像；（C）细胞先用LPS（1 mg·mL-1）和IFN-γ（50 ng·mL-1）刺激6 h，再用PyP（2 μmol/L，15 min）处理后影像；（D）细胞先用LPS（1 mg·mL-1）、IFN-γ（50 ng·mL-1）和AG（5 mmol/L）共同刺激6 h，再用PyP（2 μmol/L，15 min）处理后影像；（E）细胞先用LPS（1 mg·mL-1）、IFN-γ（50 ng·mL-1）和TEMPO（300 μmol/L）共同刺激6 h，再用PyP（2 μmol/L，15 min）处理后影像；（F）细胞先用LPS（1 mg·mL-1）、IFN-γ（50 ng·mL-1）和FeTMPyP（30 μmol/L）共同刺激6 h，再用PyP（2 μmol/L，15 min）处理后影像；（G）A-F 的荧光定量图。荧光信号收集范围在570 nm～750nm（λex：561nm），标尺为20 μmFig. 7 Fluorescence images of RAW264.7 murine macrophages under different conditions. (A)cells were treated with PyP(2 μmol/L,15 min)and then imaged;(B)PyP-loaded cells were treated with SIN-1(1 mmol/L,30 min)and then imaged;(C)cells were stimulated with LPS(1 mg·mL-1)and IFN-γ(50 ng·mL-1)for 6 h and then with PyP(2 μmol/L,15 min);(D)NOS inhibitor AG(5 mmol/L)was co-incubated during LPS/IFN-γ stimulation and then with PyP(2 μmol/L,15 min);(E)superoxide inhibitor TEMPO(300 μmol/L)was co-incubated during LPS/IFN-γ stimulation and then with PyP(2 μmol/L,15 min);(F)FeTMPyP(30 μmol/L)was co-incubated during LPS/IFN-γ stimulation and then with PyP(2 μmol/L,15 min)(G)Quantification of fluorescence intensities of confocal microscopy images of RAW264.7 murine macrophages obtained under conditions A-F. The image from the band path of 570-750 nm upon excitation of 561 nm. Scale bar:20 μm

3 结论

综上所述，本工作基于增强的PET 机理，将2，4-二甲基吡咯反应位点与吡罗红荧光团的9 号位通过共价键直接相连，设计合成了新型的荧光探针PyP。探针PyP 可以高选择性、高特异性对ONOOˉ作出荧光增强的响应。此外，探针PyP 具有好的水溶性及稳定性、长的吸收和发射波长和优良的生物兼容性，可以用于影像RAW264.7 细胞中外源性及内源性的ONOOˉ。该探针的开发对于人们了解ONOOˉ的生理功能以及ONOOˉ相关疾病诊断方面具有潜在的应用价值。