氯吡格雷对顺铂介导的化疗痛小鼠脊髓背角Iba-1及促炎因子的影响*

陈学泰 刘宇程 范利君 陈立平 申 文△

（1 徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室，徐州 221004；2 盐城市第一人民医院麻醉科，盐城 224700；3 徐州医科大学附属医院疼痛科，徐州 221004）

近年来，国内越来越多的文献报道铂类、紫杉类、长春生物碱类等抗肿瘤药物在治疗肿瘤的同时，可引起病人痛觉过敏或痛觉超敏，部分病人还表现为手套样或袜套样感觉异常，临床上称为化疗药物诱导的神经病理性疼痛 (chemotherapy-induced neuropathic pain, CINP)，简称化疗痛[1～3]。CINP 严重限制了抗肿瘤药物的应用，影响了肿瘤病人的生活质量。然而，目前针对CINP 的有效治疗方法有限，CINP 的机制也尚未明确，国内外均未发现能预防和控制这一并发症的有效药物和方法，所以开展控制化疗痛的新药研究，阐明其分子机制是目前该领域的研究热点。

最新研究证实，中枢敏化在CINP 的发病机制中起关键作用，越来越多的研究表明，中枢神经胶质细胞在CINP 中发挥重要作用[4～6]。脊髓背角是化疗引起痛觉过敏的主要作用部位。在脊髓中，痛觉信息由感觉神经元传递，然后通过脊髓神经元-神经元和胶质细胞-神经元之间的多种信号通路进行处理。除了神经元机制外，脊髓胶质细胞，特别是小胶质细胞和星形胶质细胞，在化疗诱导的痛觉过敏的发生中发挥了关键作用。研究表明，小胶质细胞的激活有助于顺铂诱导的神经性疼痛。被激活的小胶质细胞能通过趋化作用介导伤害性信号，并通过小胶质细胞和神经元的相互作用释放促炎细胞因子[7～9]。

氯吡格雷 (Clopidogrel)是一种有效、口服的靶向血小板P2Y12 的抗血栓化合物[10,11]。有报道氯吡格雷对P2Y12 的作用依赖于其在肝脏代谢过程中产生的活性代谢物，也观察到其通过血脑屏障转运[12]。近年来，大量的文献指出，氯吡格雷能够通过抑制小胶质细胞P2Y12 受体产生镇痛作用。有研究指出口服10 mg/kg 氯吡格雷可缓解脊神经结扎所引起的触觉异常和热痛觉过敏[13]。也有研究报告称，更高的剂量 (25 mg/kg) 对缓解触觉异常具有更持久的影响[14]。然而，氯吡格雷能否缓解顺铂所介导的痛觉过敏以及潜在的细胞和分子机制仍不清楚。基于以上证据，本研究采用顺铂诱导的神经病理性疼痛模型，探讨氯吡格雷对顺铂介导的化疗痛小鼠脊髓背角Iba-1 及促炎因子的影响，为进一步明确氯吡格雷在化疗痛中的作用提供研究思路。

方 法

1.实验动物及试剂

实验采用SPF 级健康C57BL/6J 8 周雄性小鼠，由徐州医科大学实验动物中心提供。所有实验操作程序均经徐州医科大学实验动物福利与应用委员会批准，遵守国际卫生学会《实验动物福利和应用指南》。山羊抗Iba-1 (Abcam, USA)，兔抗GAPDH (CST,USA)，TNF-α、IL-1β 及IL-6 ELISA 试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

2. 顺铂介导的化疗痛动物模型制备及给药方法

C57BL/6J 8 周雄性小鼠40 只，采用随机数字表法分为4 组（每组10 只）：对照组（Control 组）；氯吡格雷组 （Clopidogrel 组）：氯吡格雷10 mg/kg灌胃连续5 天；化疗痛组（Cisplatin 组）：小鼠进行腹腔注射顺铂 2.3 mg/kg , 连续注射5 天，休息5天，再连续注射5 天，再休息5 天；化疗痛 + 氯吡格雷组（Cisplatin + Clopidogrel 组）：顺铂最后1 次注射后，开始氯吡格雷10 mg/kg 灌胃，连续5天。顺铂给药前、给药后第 1、5、10、15、20 天使用vonFrey 测痛仪测定大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)（ 第20天行为学检测时间在氯吡格雷腹灌胃4 h 后），采用Western Blot 及免疫荧光方法检测Iba-1，给药后采用ELISA 检测脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6表达。

3.疼痛行为学检测

采用MWT 值来反映小鼠的机械痛阈。本实验使用的vonFrey 细丝包括：0.02、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0 和1.4 g。将小鼠放置到10 cm×10 cm×15 cm 的有机玻璃盒中，每次实验前适应约半小时。小心将vonFrey 细丝置于小鼠足底并使其弯曲，保持弯曲3～4 s，且同一只小鼠的同一侧足底相邻2 次刺激之间需间隔10 min。初次刺激时使用克度为0.16 的vonFrey 细丝。当小鼠足底出现敏锐的抬脚反应，则为阳性反应，在vonFrey 表中记作X。反之，则为阴性反应，记作O。从出现阴、阳性反应变化开始，共进行6 次试验。试验结束后，用 50%vonFrey 反应阈值公式计算出小鼠的MWT 值。

4. Western Blot 检测

小鼠深麻醉（小鼠腹腔注射 1%戊巴比妥钠40 mg/kg）后，在冰上迅速取出脊髓腰膨大段 (L4-5)，加入裂解液进行匀浆，4℃下12, 000 rpm 离心20 min，并进行BCA 蛋白定量。配置 12%的分离胶和 5%的浓缩胶，浓缩胶电泳条件为 80 伏恒压，分离胶电泳条件为100 伏恒压，当溴酚蓝染料前端电泳至分离胶末端处时即停止电泳，转膜后 5%脱脂奶粉封闭 2 h，加入GAPDH (兔抗小鼠，1:2000)，IBA-1（羊抗小鼠，1:1000），4℃孵育过夜后 TBST 洗膜 6 次，每次5 min。加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG (1:1000)，HRP 标记的驴抗山羊IgG (1:1000) 室温孵育1 h 后TBST 洗膜6 次，每次5 min。ECL 反应、显影、定影后使用图像分析系统进行数据分析。

5.免疫荧光染色

大鼠经心脏灌注生理盐水冲去血液，再用4℃的4%多聚甲醛溶液（溶于0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液中，pH 7.4）灌注固定。取出L4-5脊髓组织，继续后固定 1～3 h，随后转入 30%蔗糖溶液脱水3 天。用冰冻切片机 (Leica CM1900)将组织切成20 μm薄片用于染色。组织片用3% 驴血清的0.3% Triton X-100 溶液常温固定1 h，再孵育小胶质细胞特异性标记物 Iba-1 抗体 4℃过夜，洗涤后常温避光孵育FITC 偶联的 IgG，用荧光显微镜和CCD 扫描相机(Leica)拍照。

6. ELISA 检测

小鼠深麻醉（腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg）后，在冰上迅速取出脊髓腰膨大段 (L4-5)，按组织净重 (g)：稀释液体积 (ml) = 1:9 的比例加入预冷的生理盐水。匀浆后于4℃，3500 rpm 离心10 min（离心半径5 cm），提取上清液并在-80℃保存。按试剂盒说明书检测蛋白并绘制标准曲线，计算出脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 浓度。

7.统计学分析

采用 SPSS 16.0 软件进行统计分析，痛阈值分析采用重复测量的方差分析，灰度值比较采用单因素方差分析，组间比较方差齐性时采用 LSD 法，计量数据均以均数±标准差(±SD)表示，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1. 氯吡格雷对顺铂介导的化疗痛小鼠小鼠MWT的影响

给药前各组小鼠的MWT 差异无统计学意义。与Control 组相比，腹腔注射顺铂 5 次后（第5 天），小鼠 MWT 显著性降低 (P＜ 0.05)，并且一直持续到20 天，提示顺铂诱导化疗痛小鼠模型成功。与Cisplatin 组相比，Cisplatin + Clopidogrel 组能够明显逆转顺铂介导的化疗痛小鼠的痛阈降低，差异有统计学意义 (P＜ 0.05)。而正常组小鼠氯吡格雷灌胃前后痛阈无明显差异（见图1）。以上结果表明Clopidogrel 能减轻顺铂介导的化疗痛小鼠的机械痛觉过敏。

图1 氯吡格雷灌胃对顺铂介导的化疗痛小鼠机械缩足反射阈值的影响(±SD,n =10)*P＜ 0.05，与control 组相比；#P＜ 0.05，与cisplatin 组相比Fig. 1 Effects of clopidogrel on MWT in mice with cisplatininducedpain (±SD, n= 10)*P ＜ 0.05, compared with group control; #P ＜ 0.05,compared with group cisplatin.

2. 氯吡格雷对顺铂介导的化疗痛小鼠脊髓Iba-1蛋白表达的影响

Western Blot 结果显示：在第20 天，与Control组相比，Cisplatin 组小鼠脊髓Iba-1 表达明显增多(P＜0.05)，与Cisplatin 组相比，Cisplatin + Clopidogrel 组小鼠氯吡格雷灌胃后，氯吡格雷可以明显逆转化疗痛小鼠脊髓Iba-1 蛋白表达增多，差异有统计学意义（P＜ 0.05，见图2A），提示氯吡格雷可以抑制顺铂介导的化疗痛小鼠脊髓Iba-1 的表达。

免疫荧光结果显示：在第20 天，Control 组小鼠脊髓背角小胶质细胞数量较少；Cisplatin 组小鼠脊髓背角小胶质细胞数量明显增多(P＜ 0.05)；Cisplatin + Clopidogrel 组小鼠氯吡格雷灌胃后，氯吡格雷可以明显逆转化疗痛小鼠脊髓小胶质细胞数量增多，差异有统计学意义（P＜ 0.05，见图2B），提示氯吡格雷可以抑制顺铂介导的化疗痛小鼠脊髓背角小胶质细胞活性。

3.氯吡格雷对顺铂介导的化疗痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 蛋白表达的影响

ELISA 结果显示：在第20 天，与Control 组相比，Cisplatin 组小鼠脊髓 TNF-α、IL-1β 及IL-6 表达显著升高 (P＜ 0.05)，与Cisplatin 组相比，Cisplatin + Clopidogrel 组小鼠氯吡格雷灌胃后，氯吡格雷可以明显逆转化疗痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 表达增多，差异有统计学意义（P＜ 0.05，见图3）。提示氯吡格雷可以抑制顺铂介导的化疗痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β及IL-6 的表达。

图3 氯吡格雷对顺铂介导的化疗痛小鼠促炎因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 表达的影响 (±SD)*P ＜ 0.05，与control 组相比；#P ＜ 0.05，与cisplatin 组相比Fig. 3 Effect of Clopidogrel on the expression of pro-inflammatory factor TNF-α, IL-1β and IL-6 in cisplatin induced chemotherapy pain (±SD)*P ＜ 0.05, compared with group control; #P ＜ 0.05, compared with group cisplatin.

讨 论

化疗痛(CINP)是化疗药物如铂类化合物（顺铂）、紫杉烷、长春花生物碱的主要不良反应。顺铂作为第一代抗肿瘤药物广泛用于治疗实体肿瘤，尤其是睾丸癌、卵巢癌和膀胱癌。铂类药物能够与DNA 结合，影响DNA 复制，抑制转录，从而诱导细胞凋亡来发挥其抗肿瘤活性[15]。但化疗痛的机制至今尚未明确。近年来，有关中枢胶质细胞在CINP 中的作用的研究越来越多。研究表明，紫杉醇治疗后脊髓中小胶质细胞表达明显增多，以及小胶质细胞的抑制剂二甲胺四环素可以显著逆转紫杉醇引起的冷痛觉过敏。这些研究证明了脊髓小胶质细胞在化疗痛中的关键作用。然而，也有证据表明脊髓星形胶质细胞的激活与奥沙利铂、硼替佐柏和紫杉醇诱导的神经性疼痛有关[16,17]。也有相关研究表明，小胶质细胞的激活有助于顺铂诱导的神经性疼痛。顺铂能够激活小胶质细胞，使其释放大量促炎因子介导化疗痛，并且不激活星形胶质细胞。注射小胶质细胞抑制剂二甲胺四环素能减轻顺铂诱导的CINP。而星形胶质细胞抑制剂的L-AA 对顺铂诱导的CINP 无明显改善[7]。造成不同胶质细胞激活原因可能与化疗药物的种类和剂量有关。本研究结果与报道的一致，顺铂能引起小胶质细胞的激活，提示了小胶质细胞激活在顺铂诱导的化疗痛机制中发挥了重要作用，但星形胶质细胞是否激活及小胶质细胞激活调节的具体机制还需进一步研究。

氯吡格雷是一种有效的、口服的靶向血小板P2Y12 的抗血栓化合物，其安全性来自广泛的临床项目的研究结果[10,11]。氯吡格雷对P2Y12 的作用依赖于其在肝脏代谢过程中产生的活性代谢物，也观察到其通过血脑屏障的转运[12]。近年来，大量的文献指出，氯吡格雷能够通过抑制小胶质细胞P2Y12受体产生镇痛作用[13,14]。临床上，氯吡格雷的活性代谢物需要连续几天给药才能达到治疗效果，因此，本研究连续5 天给予氯吡格雷，使其有效地抑制P2Y12R。氯吡格雷的镇痛作用已在脊神经结扎模型[18]、慢性偏头痛模型[19]中得到证实，但在化疗诱导的神经病理性疼痛中应用还未见报道，本研究结果显示：氯吡格雷能减轻顺铂介导的化疗痛小鼠的机械痛觉过敏，并且氯吡格雷抑制了顺铂介导的化疗痛小鼠脊髓小胶质细胞蛋白的表达。

有文献报道指出，在疼痛模型中，脊髓中小胶质细胞通过激活细胞外信号调节激酶和p38 信号通路促进促炎细胞因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 的持续产生。一方面，这些促炎细胞因子通过作用于脊髓小胶质细胞、星形胶质细胞自身及周围相应受体，促进胶质细胞介导的“炎症汤”的形成。另一方面，它们通过作用于突触前和/或突触后膜中相应的受体，直接介导突触可塑性和神经元兴奋性[20,21]。ELISA结果显示，顺铂腹腔注射后，促炎因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 表达显著升高，氯吡格雷对抑制了顺铂介导的化疗痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 蛋白表达增多。本研究表明氯吡格雷能够缓解顺铂介导的化疗痛小鼠痛觉过敏，其机制可能与炎症反应有关。而氯吡格雷是否能够通过抑制脊髓小胶质细胞活化，减少促炎因子的合成和释放来缓解化疗痛还有待于实验进一步证实。

综上所述，在本实验条件下氯吡格雷能够抑制顺铂诱导的神经病理性疼痛，其作用机制可能与抑制脊髓小胶质细胞激活及其炎症反应有关。这为阐明氯吡格雷调控化疗痛的发展过程提供了实验依据，并为临床治疗化疗痛提供了新的思路。