黑苦荞中总黄酮2种提取方法的工艺优化

贺平 王午豪 尚丽君 孙红梅 魏亮亮 刘冰杰 周晓华 魏红 王铁良 郭洁

摘要 [目的]提高苦荞黄酮类化合物的综合利用率，优化提取工艺。[方法]以乙醇为提取液，通过超声波和恒温水浴振荡2种方法进行提取，分别通过提取的时间、温度、乙醇浓度、固液比、超声功率进行单因素试验，再在单因素的基础上通过正交试验确定最佳提取条件和方法。[结果]超声法的最佳优化方案：超声功率250 W，固液比1∶50，乙醇浓度70%，超声时间40 min;恒温水浴振荡法最佳方案：恒温45 ℃，水浴振荡时间2.0 h，乙醇浓度80%，固液比1∶30。[结论]经验证，优化方案科学合理，可作为黑苦荞中黄酮类化合物开发和研究的依据。

关键词 黑苦荞;黄酮类化合物;提取工艺

中图分类号 TQ 914.1  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）16-0178-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.048   开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Process Optimization of Two Extraction Methods of Total Flavonoids from Black Bitter Buckwheat

HE Ping1，2，3，WANG Wu-hao1，3， SHANG Li-jun1 et al （1.Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology， Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，Henan 450002;2.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products （Zhengzhou）， Ministry of Agriculture，Zhengzhou，Henan 450002;3.Henan Key Laboratory of Grain Quality and Safety and Testing， Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract [Objective]To improve the comprehensive utilization rate of total flavonoids from black buckwheat and optimize the extraction process. [Method]Using ethanol as the extract， and total flavonoids were extracted by ultrasonic wave and constant temperature water bath. The single factor experiment is carried out by extraction time， temperature， ethanol concentration， solid-liquid ratio and ultrasonic power.Based on the orthogonal test， the optimal extraction conditions and methods are determined.[Result]The best optimization scheme for ultrasonic method： ultrasonic power 250 W， solid-liquid ratio 1∶50， ethanol concentration 70%， ultrasonic time 40 min.The best solution for constant temperature water bath oscillation method： constant temperature 45 ℃， water bath oscillation time 2.0 h， ethanol concentration 80%， solid-liquid ratio 1∶30. [Conclusion]The optimized scheme has been verified to be scientific and reasonable， and can be used as the basis for the development and research of flavonoids in black tartary buckwheat.

Key words Black buckwheat;Total flavonoids;Extraction process

苦蕎麦，蓼目蓼科植物，又叫菠荞麦、乌荞麦、花荞麦等，一年生植物。生长在田野边、道路旁、山坡上、河谷中等潮湿的地方，主产川渝地区，在我国山东、河南、陕西等地也有分布。苦荞麦性味稍微带苦、属寒，有益气长力、续精增神、降气宽肠健脾胃的作用。苦荞的不同部位含有不同活性成分，其成分中黄酮类物质含量最高。因此，食用黑苦荞可以补充其他主食谷物中含量较少的营养物质，如面粉、玉米以获得营养的均衡。对于苦荞中生物活性物质的研究，主要集中于苦荞提取产物。苦荞中含量较高的生物活性物质是多酚中的黄酮类物质[1-3]。其中芦丁含量最高，占总黄酮的70%～90%[4]。

目前，提取原料中总黄酮方法有溶剂提取法、超声波提取法、微波萃取提取法、索氏提取法、酶解-溶剂法、超高压提取法等方法。Oliveira等[5]在用超声辅助提取法提取黄果西番莲种籽油粕时，发现提取物中含有黄酮，且有较强的抗氧化作用和抑菌活性。王楠等[6]在研究沙枣总黄酮的提取工艺时，使用溶剂提取、超声波提取和微波萃取提取3种方法，用单因素试验确定了总黄酮提取的最佳条件，然后采用响应面试验进行分析，得出超声波提取率最高，溶剂提取率最差，微波萃取提取节省时间，而张艳等[7]用上述3种方法提取紫苏油粕总黄酮时，得出总黄酮提取效果表现为微波萃取>超声法>乙醇法。微波和超声2种方法在具体操作时，受仪器参数和使用条件的影响而结果差异较大。王琳琳等[8]在提取枸杞总黄酮时，采用乙醇回流法、超声波提取法、超声波-微波联用提取法3种方法，得出超声波-微波联用提取法提取效率最高。Alara等[9]用微波萃取提取斑鸠菊叶中黄酮类物质。

经查阅大量资料，传统溶剂提取法、超声提取法和微波萃取提取法是3种常用方法也有一些区别，微波萃取提取法主要用于一些种皮和叶[10]中总黄酮提取，具有用时短、效率高等优点，但是受到仪器参数和型号的限制，提取溶剂是不同浓度乙醇，有一定的爆罐风险，并不实用;传统溶剂提取法是普遍的方法，具有提取时间较长、浪费人力、提取不完全等缺点。超声和恒温水浴振荡法使用普遍，操作简单，提取效果理想，但是温度、提取时间等因素影响提取率，相关研究较少。该研究通过单因素试验和正交试验优化超声法[11]和恒温水浴振荡法提取黑苦荞中总黄酮的最优条件。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 试验仪器和试验试剂分别见表1、2。

1.2 溶液的配制

1.2.1 芦丁标准溶液的配制。用电子天平准确称取0.277 6 g芦丁标准品，加入无水乙醇溶解，定容于250 mL容量瓶中，配成浓度为1.000 mg/mL储备液，然后吸取25 mL溶液于250 mL容量瓶中，配成0.1 mg/mL芦丁标准溶液，振荡摇匀，于4 ℃冷藏备用。

1.2.2 乙酸钾溶液的配制。用电子天平称取49.073 0 g乙酸钾，加去离子水溶解，定容于500 mL容量瓶中，制成98 g/L溶液，振荡摇匀。

1.2.3 硝酸铝溶液的配制。称取Al（NO 3） 3·9H 2O固体176.0 g，加入去离子水溶解，定容于1 000 mL容量瓶中，制成100 mg/L溶液，振荡摇匀。

1.2.4 30%乙醇溶液的配制。用量筒量取300 mL无水乙醇，加入700 mL去离子水制成30%乙醇溶液，置于试剂瓶中备用。50%、60%、70%、80%乙醇溶液、无水乙醇溶液同法配制，备用。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的前处理和保存。

1.3.1.1 样品的前处理。将黑苦荞置于45 ℃烘箱中干燥12 h，拿出后冷却至室温，再用粉碎机粉碎，过70目筛。

1.3.1.2 样品的保存。过筛样品干燥粉末装入密封罐，放在干燥器中备用。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制。

移液管精密吸取芦丁标准溶液（0.1 mg/mL） 0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL于50 mL容量瓶中，配成浓度分别为1、2、5、10、15、20 mg/L;加无水乙醇至总体积为15 mL，先加硝酸铝溶液1 mL，再加醋酸钾溶液1 mL，振荡摇匀后加水至刻度线，摇匀，放置1 h，用紫外分光光度计于420 nm处，以30%乙醇溶液作为空白，测定吸光度。以吸光度为纵坐标、芦丁标准溶液浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线[12-13]。

1.3.3 空白试验。不加试样，其他均按上述步骤操作。

1.3.4 吸光度和总黄酮含量测定。

移液管吸取待测溶液2 mL移入50 mL容量瓶中，按“1.3.2”操作。以试剂空白為参照，用紫外分光光度计在420 nm处测定样品溶液的吸光度，通过标准曲线得出样品溶液中黄酮类化合物的浓度（mg/L）。吸光度应在标准曲线的线性范围内。

1.3.5 样品总黄酮提取率的计算。

X=C×V 1×V 22×m×1 000×100%

式中，X为样品中总黄酮的提取率，%;C为根据标曲计算出的 浓度，mg/L; V 1为样 品稀释定容时的体积， mL;

V 2为 加显色剂后定容的体积， mL; m 为称取的样品重量，g。

1.4 试验设计

1.4.1 超声法提取单因素试验设计。

1.4.1.1 超声功率。称取1.00 g样品于锥形瓶中，加入30 mL无水乙醇，盖上塞子，分别在125、250、375、500 W功率进行超声提取40 min，每处理3次重复，过滤，用无水乙醇定容至50 mL容量瓶中待测。

1.4.1.2 超声时间。用电子天平各称取1.00 g样品加入锥形瓶中，再加入30 mL无水乙醇，盖上塞子，分别用超声125 W功率提取20、40、60、80、100 min，过滤后用无水乙醇定容于50 mL 容量瓶，待测。每处理3次重复。

1.4.1.3 乙醇浓度。用电子天平各称取1.00 g样品加入锥形瓶中，分别加入50%、60%、70%、80%、100%乙醇提取液，盖上塞子，用超声125 W 功率提取40 min，过滤后用各浓度乙醇定容于50 mL容量瓶，待测。每处理3次重复。

1.4.1.4 固液比。用电子天平各称取1.00 g样品加入锥形瓶中，再加入10、20、30、40、50 mL无水乙醇，盖上塞子，分别用超声125 W提取40 min，过滤后用无水乙醇定容于50 mL容量瓶，待测。每处理3次重复。

1.4.2 恒温水浴振荡法单因素试验设计。

1.4.2.1 水浴振荡时间。用电子天平各称取1.00 g样品加入锥形瓶中，再加入30 mL无水乙醇，盖上塞子，分别于25 ℃水浴振荡提取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h，过滤后用无水乙醇定容于50 mL容量瓶，待测。每处理3次重复。

1.4.2.2 水浴振荡温度。用电子天平各称取1.00 g样品加入锥形瓶中，再加入30 mL无水乙醇，盖上塞子，分别于25、35、45、55、65 ℃水浴振荡提取1 h，过滤后用无水乙醇定容于50 mL容量瓶，待测。每处理3次重复。

1.4.2.3 乙醇浓度。用电子天平各称取1.00 g样品加入锥形瓶中，分别加入50%、60%、70%、80%、100%乙醇，盖上塞子，于25 ℃振荡提取1 h，过滤后用各浓度乙醇定容于50 mL容量瓶，待测。每处理3次重复。

1.4.2.4 固液比。用电子天平各称取1.00 g样品加入锥形瓶中，再分别加入10、20、30、40、50 mL无水乙醇，盖上塞子，于25 ℃振荡提取1 h，过滤后用无水乙醇定容于50 mL容量瓶，待测。每处理3次重复。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 按照“1.3.2”的方法，以芦丁标准溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制出芦丁标准曲线（图1）。结果表明，芦丁标准品溶液在该范围内线性良好，符合比尔定律。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 超声法提取黑苦荞总黄酮单因素试验结果。

2.2.1.1 超声功率对黑苦荞总黄酮提取率的影响。

从图2可以看出，250 W时的总黄酮提取率远大于125 W的，当继续提高超声功率，总黄酮提取率反而降低，且375～500 W总黄酮提取率变化不明显，功率为250 W时总黄酮提取率最大。

2.2.1.2 超声时间对黑苦荞总黄酮提取率的影响。从图3可以看出，随着超声提取时间的延长，总黄酮提取率也逐渐升高，当超声时间大于60 min总黄酮提取率变化不明显，因此最佳时间条件是超声60 min。

2.2.1.3 固液比对黑苦荞总黄酮提取率的影响。从图4可看出，随着固液比的增大，总黄酮提取率也随之增大，当固液比大于1∶40（g∶mL）时，总黄酮提取率反而下降，因此固液比1∶40是最佳条件。

2.2.1.4 乙醇浓度对黑苦荞总黄酮提取率的影响。从图5可以看出，当乙醇浓度为60%，总黄酮提取率达到最高，乙醇浓度超过60%对总黄酮提取率的影响却变小。因此，60%乙醇为最佳提取条件。

2.2.2 恒温水浴振荡法提取黑苦荞总黄酮单因素试验结果。

2.2.2.1 水浴振荡时间对黑苦荞总黄酮提取率的影响。

从图6可以看出，随着水浴振荡时间的延长，总黄酮提取率逐渐增大，当时间大于3.0 h，总黄酮提取率反而下降。因此，可以得出最佳时间条件是3.0 h。

2.2.2.2 水浴振荡温度对黑苦荞总黄酮提取率的影响。从图7可以看出，随着水浴温度的升高，总黄酮提取率逐渐增大，当温度达到55 ℃时，总黄酮的提取率最高，随着水浴温度的继续升高，总黄酮提取率反而降低。因此，最佳提取温度为55 ℃。

2.2.2.3 固液比对黑苦荞总黄酮提取率的影响。从图8可以看出，固液比1∶40时总黄酮提取率最大，随后开始降低，因此最佳固液比是1∶40。

2.2.2.4 乙醇浓度对黑苦荞总黄酮提取率的影响。

从图9可以看出，当乙醇浓度逐渐升高，总黄酮提取率也随之提高，当乙醇浓度为60%时，总黄酮提取率达最高，继续增大乙醇浓度，对总黄酮提取率影响减小，考虑到研究和生产中的资源合理利用，确定60%乙醇为最佳浓度条件。

2.3 正交试验设计

2.3.1 恒温水浴振荡法。

在恒温水浴振荡单因素试验的基础上，进行固液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间4因素4水平L 16（44）正交试验。因素水平设计见表3。

2.3.2 超声法。 在超声法单因素试验的基础上，进行固液比、乙醇浓度、提取时间、超声功率4因素3水平L 9（34）正交试验。因素水平设计见表4。

2.4 正交试验结果

2.4.1 超声法。由表5可知，超声法各因素对总黄酮提取率的影响表现为乙醇浓度（D）>固液比（B）>提取时间（C）>超声功率（A），优化方案结果是A 2B 3C 1D 3，即超声功率250 W，固液比1∶50，超声时间40 min，乙醇浓度70%。

2.4.2 水浴振荡法。由表6可知，各因素对总黄酮提取率影响表现为乙醇浓度（C）>固液比（D）>提取时间（B）>提取温度（A），正交试验优化方案结果为A 3B 3C 4D 3，即水浴振荡温度45 ℃，水浴振荡时间2.0 h，乙醇浓度80%，固液比1∶30。

2.5 验证试验和稳定性试验

2.5.1 稳定性试验。

超声法和恒温水浴振蕩法各随机挑选1组试验，即超声最大功率500 W，100%乙醇，超声60 min，固液比为1∶30;水浴振荡温度55 ℃，时间2.0 h，100%乙醇，固液比1∶30。2组同时进行稳定性试验：取试验组样品溶液每1.0 h进行1次吸光度的测定，结果见表7，样品溶液在3.0 h内基本稳定。

2.5.2 验证试验。将2种方法通过正交分析得出的最佳优化条件进行3次重复性验证试验。按照超声法最佳方案：超声功率250 W，固液比1∶50，70%乙醇，超声时间40 min，总黄酮平均提取率4.36%，高于正交试验中最大提取率4.28%，因此工艺优化条件合理，符合预期结果。恒温水浴振荡法最佳方案：恒温温度45 ℃，水浴振荡时间2.0 h，80%乙醇，1∶30固液比，总黄酮平均提取率4.16%，高于正交试验中最高提取率（4.12%）。

3 结论

该试验采用超声法和恒温水浴振荡法，以乙醇为溶剂提取黑苦荞中总黄酮，每种方法分别进行单因素试验，再在单因素的基础上进行正交试验，通过正交分析得到各因素的影响主次顺序，其中超声法影响因素表现为乙醇浓度>固液比>提取时间>超声功率;恒温水浴振荡法为乙醇浓度>

固液比>提取时间>提取温度。通过正交试验得到最佳优化方案，其中超声法最佳方案：超声功率250 W，固液比1∶50，乙醇浓度70%，超声时间40 min;恒温水浴振荡法最佳方案：恒温45 ℃，水浴振荡时间2.0 h，乙醇浓度80%，固液比1∶30。由此可以看出，2种方法最佳优化方案得到的总黄酮提取率差别微小，可以忽略，但是超声法提取时间要远远小于恒温水浴振荡法。

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