基于离子液体与超声波辅助提取普洱茶茶多酚的工艺优化

万 常，李启慧，曾超珍，刘志祥

中南林业科技大学 生命科学与技术学院/林业生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004

茶多酚是茶叶中形成茶叶色香味的关键成分[1]。同时也是一种新型天然抗氧化剂，具有抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、降血压、降血脂、提高机体免疫力等药理和保健功能[2]。

离子液体被用于液-液萃取，由于离子液体具有蒸汽压很低、可以忽略的挥发性、不可燃性、热稳定性和选择性溶解度等显著特性，被认为是环境友好型的溶剂[3]。超声波技术具有快速、节能、溶剂用量少、产品纯度高并获得更高的收率等优点[4]，超声波辅助离子液体方法被广泛应用于活性成分的萃取分离方面，如茶叶绿原酸[5]、菊花异绿原酸C[6]、白花葛茎和辣木叶多糖[7-8]、石榴籽原花青素[9]、杜仲皮总木脂素[10]、黄柏总生物碱[11]、黑豆异黄酮[12]、柚子皮、艾叶、银杏叶及葛根总黄酮[13-16]等。

普洱茶（Camellia sinensis var. assamica）具有抗癌、抗血栓、抗氧化、助消化、降脂减肥和降血糖等功效[17-19]。普洱茶富含茶氨酸、茶多酚、咖啡碱及没食子酸等[20]，其中没食子酸、咖啡碱和茶多酚对其品质的影响很大[21]。迄今为止，还未见超声波辅助离子液体提取普洱茶茶多酚的报道。

本试验采用绿色环保溶剂离子液体（1-丁基-3-甲基咪唑溴盐，[BMIM]Br）为溶剂，采用响应面法优化超声波辅助提取普洱茶中的茶多酚，探讨其最佳提取工艺，以期为茶叶中茶多酚的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普洱茶（熟茶，市售），置于干燥箱中80℃烘干后，用高速组织捣碎机粉碎，过80目筛，密封保存备用。1-丁基-3-甲基咪唑溴盐（纯度≥99%，默尼化工科技有限公司）。

1.2 设备与仪器

101-2AB型电热鼓风干燥箱（北京中兴伟业世纪仪器有限公司）；TG16KR型高速离心机（东旺仪器有限公司）；DS-1型高速组织捣碎机（上海左乐仪器有限公司）；HN-1000Y型超声波细胞粉碎机（上海达洛科学仪器有限公司）；UV-752C型紫外可见分光光度计（广东航信科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 茶多酚的提取

称取0.5 g茶叶粉碎样，加入一定比例的[BMIM]Br作为提取溶剂，超声波提取一段时间后，4 000 r/min下离心10 min，收集滤液，离心，取上清液。在波长为540 nm处测定其吸光值，每组均重复3次。

1.3.2 茶多酚标准曲线制作

精准称取茶多酚标准样品5.0 mg，加入去离子水溶解，定容至50 mL（质量浓度0.1 mg/mL），此为标准溶液。分别取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL茶多酚标准溶液，加入dd H2O（4 mL）和酒石酸亚铁溶液（5 mL，5 mg/mL），混匀后再加入磷酸盐缓冲液（pH 7.5），定容至25 mL。测定其吸光度（540 nm），每个处理重复3次。以吸光度为纵坐标与茶多酚浓度为横坐标得到线性回归方程：y = 0.621x+0.0233，R2 = 0.9991。

1.3.3 茶多酚提取率的测定

参考陈峰等的方法[22]，每个处理重复3次，计算平均值。

式中：X—普洱茶提取液中茶多酚的浓度，mg/mL；A—在波长为540 nm下测定吸光值；V—溶液定容体积，mL；n—溶液稀释倍数；m—普洱茶茶粉的质量，g。

1.3.4 单因素试验

考察[BMIM]Br浓度（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mol/L）、提取时间（10、15、20、25、30 min）、超声波功率（300、400、500、600、700 W）和料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）对茶多酚提取效果的影响；各因素水平固定值为：0.3 mol/L [BMIM]Br，提取时间为20 min，料液比1∶20，超声波功率为500 W。

1.3.5 响应面优化试验

采用Design-Expert v8.0.6软件，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理[23]。[BMIM]Br浓度为0.3 mol/L，以料液比（A）、提取时间（B）和超声功率（C）三因素作为自变量，每个因素三个水平，以普洱茶茶多酚提取率为响应值设计响应面优化试验。因素和水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.4 数据分析

采用Excel 2019进行数据统计，采用Design-Expert v8.0.6软件进行响应面优化分析[23]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同[BMIM]Br溶液浓度对茶多酚提取率的影响

如图1所示，[BMIM]Br溶液的浓度为0.2～ 0.4 mol/L时，普洱茶茶多酚的提取率随其浓度的升高先上升后下降，浓度为0.3 mol/L时提取率最高；而当浓度高于0.4 mol/L后提取率呈缓慢上升的趋势，这可能是由于在超声波状态下，超声的空化效应、热效应及机械搅拌等作用极大地增加了有效成分的溶解和扩散，其影响远大于增加离子液体浓度。因此，从原料经济效益角度出发，[BMIM]Br溶液浓度采用0.3 mol/L为宜。

图1 离子浓度对普洱茶茶多酚提取率的影响Figure 1 Effect of ion concentration on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.1.2 不同提取时间对茶多酚提取率的影响

如图2所示，不同提取时间对普洱茶茶多酚的提取率影响较大，在提取时间为10 ～ 30 min时，普洱茶茶多酚提取率呈现先升高后下降的趋势，在提取时间为20 min时提取率最高。在提取时间20 ～ 30 min时普洱茶茶多酚的提取率有所下降，可能是由于提取过程中在过长时间的超声波作用下导致浸提液温度升高使得部分茶多酚被降解氧化，茶多酚含量减少；也可能是细胞内外有效成分含量已达到动态平衡，导致普洱茶茶多酚提取率降低。因此，超声提取时间选择20 min左右为宜。

图2 提取时间对普洱茶茶多酚提取率的影响Figure 2 Effect of extraction time on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.1.3 不同超声波功率对茶多酚提取率的影响

如图3所示，超声波功率为300 ～ 600 W时茶多酚的提取率随着超声波功率的增加而升高，600 W时达到最大值；之后随着超声波功率的增大茶多酚的提取率呈下降趋势，其原因可能是随着超声波功率增大，溶液的振动频率加快，有利于茶多酚的浸出，但功率过高振动过快时会引起溶液温度的升高而降解部分茶多酚，造成茶多酚损失。因此本试验超声波功率选择600 W。

图3 超声波功率对普洱茶茶多酚提取率的影响Figure 3 Effect of ultrasonic power on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.1.4 不同料液比对茶多酚提取率的影响

从图4可知，一开始增加提取溶剂的用量，茶多酚的提取率升高，并在茶叶与溶剂比为1∶30时提取率达到最大；此后，随着增加提取溶剂，提取率缓慢降低。可能是开始溶剂用量较少，超声波作用于茶叶较困难，茶多酚溶出速度慢，浸出率较低；后随着提取溶剂用量的增加，茶多酚的提取率先上升后下降，呈现这种趋势的原因可能是离子液体溶液达到一定用量后茶多酚基本萃取完全，再加大提取溶剂的用量时样品中残留的茶多酚也很难被萃取，且随提取溶剂使用量增大，使得液体的粘度增大，扩散能力变差，溶液渗到样品基质内部的难度加大，从而导致提取率下降。本试验研究料液比选择1:30。

图4 料液比对普洱茶茶多酚提取率的影响Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of tea polyphenols from Pu-erh tea

2.2 响应面试验结果

2.2.1 Box-Behnken中心组合试验结果

在单因素分析试验的基础上，选择[BMIM]Br溶液浓度为0.3 mol/L，以料液比（A）、提取时间（B）、超声功率（C）三因素作为自变量，每个因素三个水平，以普洱茶茶多酚提取率为响应值设计响应面分析试验。Box-Behnken中心组合试验方案及结果如表2所示。

表2 响应面试验结果Table 2 Response surface test results

利用Design-Expert v8.0.6软件对所得的试验数据进行回归整理，结果如表3所示。各因素经回归拟合后，得到茶多酚提取率的二次多项式回归模型：

茶多酚提取率（%）=-32.44312 + 0.33275×A+ 1.96550×B + 0.053250×C-7×10-4×A×B +7.25×10-5×A×C-2.15×10-4×B×C-5.85×10-3A2-0.0448×B2-4.325×C2。

由表3可知，F = 67.94，P < 0.0001，说明该模型极显著，具有意义；失拟项不显著（P=0.4984 > 0.05），表明该模型具有较高的拟合度，未知因素干扰小。模型的决定系数R2= 0.9887，校正决定系数，说明回归方程相关性高，试验误差小，稳定性和可靠性较好，可有效分析和预测浸提茶多酚工艺参数。此外，分析结果表明一次项C和二次项A2、B2、C2均对响应值影响极显著，一次项B表现为显著。F数值越大，影响程度越大（FA= 2.97、FB=14.66、FC= 64.41）。

表3 回归模型分析Table 3 Regression model analysis

2.2.2 Box-Behnken响应面分析交互作用

为了更直观深入地探讨各个因素间的交互作用，采用Design-Expert v8.0.6软件绘制空间曲线图与等高线图进行直观分析，结果如图6 ～图8所示。

从图6 ～ 图8可看出，在空间曲面图中，曲面坡度越陡，表明因素间交互作用越强；在等高线图中，封闭曲线越趋于椭圆表明因素间交互作用越强；同一椭圆形的曲线上茶多酚的提取率相同，中心点最高。由此可知，超声波功率和提取时间对茶多酚提取率的交互效应较强，而提取时间和料液比对茶多酚提取率的交互效应次之，超声波功率和料液比对茶多酚提取率的交互效应最弱。

图6 提取时间和料液比交互作用Figure 6 Interaction between extraction time and solid-liquid ratio

图7 超声功率和料液比交互作用Figure 7 Interaction between ultrasonic power and solid-liquid ratio

图8 超声功率和提取时间交互作用Figure 8 Interaction between ultrasonic power and extraction time

从各因素影响程度分析，再结合各因素的F值，能反映出各参数对茶多酚提取率的影响大小，三个因素的影响为：C（超声功率）> B（提取时间）> A（料液比）。

2.2.3 最佳提取工艺的确定与验证

通过对回归方程的求解，预测得到浸提茶多酚最佳提取工艺条件为：[BMIM]Br溶液浓度0.3 mol/L、料液比30 mL/g、提取时间20 min、超声波功率590 W。在此条件下对普洱茶茶多酚进行提取，重复3次，茶多酚的提取率平均值为8.40%，与预测值8.36%接近，表明该模型提取条件参数可靠，响应面优化超声波辅助法提取普洱茶茶多酚是可行的，该提取工艺具有一定的应用价值。

2.3 不同提取方法比较

结果如表4所示。离子液体相比于乙醇溶剂具有更好的溶解性，超声波辅助提取茶多酚较传统溶剂浸提法具有明显优势，提取率大大提高。

表4 不同提取方法对茶多酚提取率的影响Table 4 Effects of different extraction methods on the extraction rate of tea polyphenols

3 结论

本试验以普洱茶为材料，选用离子液体（[BMIM]Br）为提取溶剂，结合超声波辅助方法对[BMIM]Br浓度、提取时间、超声功率、料液比进行单因素与响应面试验，优化提取普洱茶茶多酚的最佳提取工艺条件。试验结果表明，利用响应面法建立的回归模型具有高度的显著性，方程对试验拟合较好，各个因素对普洱茶茶多酚提取率的影响大小为：C（超声功率）> B（提取时间）> A（料液比），普洱茶茶多酚的最佳提取工艺为：0.3 mol/L [BMIM]Br溶液、料液比1∶30、超声时间20 min、功率590 W。在此提取条件下，茶多酚提取率为8.40%，与预测值8.36%接近；由此可以得出，超声波辅助离子液体提取普洱茶中茶多酚具有较高的得率。离子液体可作为提取溶剂应用于茶叶中茶多酚的提取，该工艺稳定、可行，可为普洱茶茶多酚的提取与开发利用提供参考。