一种茶树新害虫——贡山喙蓟马Mycterothrips gongshanensis 的鉴定

李 帅，孟泽洪*，吕召云，修春丽，张金峰，杨 文，周玉锋

1. 贵州省农业科学院 茶叶研究所，贵州 贵阳 550006；2. 山东省蚕业研究所，山东 烟台 264002；

3. 中国农业科学院 茶叶研究所，浙江 杭州 310008；4. 贵州省农业科学院 生物技术研究所，贵州 贵阳 550006

害虫为害是影响茶叶产量和品质的主要因子之一。近40年来，我国茶园害虫的发生经历了由鳞翅目食叶类害虫向小型刺吸式害虫演替和由发生代数少的种类向发生代数多的种类演替的过程，茶树吸汁性害虫的防治将成为未来的研究重点[1]。蓟马是一类重要的茶树吸汁性害虫，通常以成虫和若虫锉吸茶树嫩梢嫩叶，导致被害叶片褐化、叶质僵脆、萎缩卷曲甚至枯焦、脱落，一年可发生10余代，严重影响茶叶生产[2-3]。在我国，已报道的茶树蓟马种类有20余种[4-7]，其中，以茶黄硬蓟马Scirtothrips dorsalis Hood和茶棍蓟马Dendrothrips minowai Priesner危害最为严重。茶黄硬蓟马是我国南方茶区重要害虫之一[8]，自上世纪八十年代起便严重影响广东、广西、湖南、江西等地的茶叶生产[9]；2006年，福建省华安县茶黄蓟马曾大面积发生，受害茶园一般减产7.1% ～ 9.6%，严重的达18.7%[10]。茶棍蓟马在我国以贵州发生最为严重，时有茶场暴发成灾，产量损失在50%，甚至60%以上[11-12]，近年来更是发生了种群扩张[13]，在浙江、江西、江苏、湖北等省亦发现有严重为害[1]。此外，如褐三鬃蓟马Lefroyothrips 1efroyi[3]、花蓟马 Frankliniella intonsa[14]、华简管蓟马Haplothrips chinensis[15]等种类虽常见于各地茶园，但鲜有严重危害的报道。

自2014年以来，我们在贵州发现一种严重影响夏秋茶生产的蓟马类害虫，在贵州有20余个县市发生，并在多地茶园暴发成灾，造成叶片脱落，芽梢光秃。由于该蓟马的为害习性特殊：喜藏匿于芽叶间隙内为害，受害叶片叶尖均匀褐化变硬等，其形态特征亦与国内已报道的常见茶树蓟马种类均不相同，曾将其初步鉴定为毛腹喙蓟马Mycterothrips setiventris Bagnall[16]。但在详细的形态特征比对之后，本文将该蓟马准确鉴定为与毛腹喙蓟马极为近似的同属另外一种，即贡山喙蓟马M. gongshanensis Li, Li &Zhang。从发生程度和为害性上看贡山喙蓟马已成为贵州一种重要的茶树吸汁性害虫；此外，在云南保山[4]和西双版纳等地该蓟马亦有被发现，说明其有较强的环境适应性。鉴于此，本文首次记录该种蓟马全虫态形态特征，同时通过实验获取了该蓟马线粒体COI基因的分子数据（DNA条形码），为该害虫的准确鉴定和遗传多样性研究提供参考，以便对其进行精准防控。

1 材料与方法

1.1 形态观察与鉴定

1.1.1 活体标本显微观察

活体标本采自于贵州省惠水县长岩村云顶茶业基地（26°9’0”N，106°43’11”E），采集时，用剪刀剪取被贡山喙蓟马为害过的茶树芽头（一芽一叶）置于保鲜盒内，带回室内饲养观察。

成虫观察：用自制吸虫器吸取成虫标本于培养皿内进行观察。由于贡山喙蓟马对光照有强烈的逃避反应，观察前先将活体标本置于-20℃冰箱冷冻麻痹3 min，取出后立刻置于基恩士VHX-5000超景深三维显微系统下进行观察、记录、拍照和测量。

卵的观察：用尖头镊子轻轻将外层芽叶剥开，并沿中脉将芽叶剪成两半，找到卵粒准确位置，用解剖刀从卵粒附近划开至叶片边缘，用两把尖头镊子沿划痕轻轻将包裹卵粒的那部分叶肉组织撕开，取出完整卵粒置于基恩士VHX-5000超景深三维显微系统下进行观察、记录、拍照及测量。

若虫观察：将采集回来的芽叶挑除全部成、若虫后进行培养，每日观察2次，待1龄若虫孵化后开始单头饲养并拍照记录，每次蜕皮后（即2龄、3龄、4龄）均置于基恩士VHX-5000超景深三维显微系统下进行观察、记录、拍照和测量。

1.1.2 玻片标本显微观察

参照张宏瑞等[17]的方法，标本制作前先进行浸解（10%氢氧化钠溶液浸泡24 h），之后用超纯水冲洗多次以清除虫体内容物，再置于30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%和100%乙醇溶液中进行逐级脱水，脱水后的蓟马转移至丁香油中进行软化，用解剖针挑取软化好的蓟马标本放入滴有二甲苯的载玻片上于解剖镜下进行整姿，注意盖片后若仍有气泡，可在酒精灯或小太阳取暖器上加热赶出气泡，以中性树胶封片。玻片标本置于Nikon DSRi2显微成像系统下进行拍照，记录。

1.2 DNA条形码研究

1.2.1 标本采集

用于分子鉴定的所有标本均为成虫，采集信息见表1。于茶园中，利用自制吸虫器吸取蓟马活体标本，并转移至盛有75%乙醇溶液的封冻管中带回室内，于-20℃冰箱内保存备用。

表1 标本采集信息Table1 Specimen collection information

1.2.2 DNA提取、PCR扩增与测序

1.5.2 各种植入性输液泵和留置导管，为非铁磁性或弱磁性，进行MRI检查通常是安全的。携带胰岛素泵进行MRI检查，可破坏胰岛素泵功能，故检查前要移除胰岛素泵。

参照张利娟等[18]基因组DNA的提取方法对单头蓟马样本提取DNA。对COI基因DNA条形码标准片段进行PCR扩增，引物序列为通用引物[19-20]。引物序列：

LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAG ATATTGG-3'

HC02198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAA AAAATCA-3'

PCR扩增体系：10×PCR缓冲液 5 µL，25 mmol/L MgCl24 µL，2.5 mmol/L dNTP 混 合液 4 µL，10 µmol/L 的 引 物 各 1.5 µL，5 U/µL的TaKaRa TaqDNA聚合酶0.3 µL，模板DNA 2 µL，加 dd H2O至50 µL。反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性0.5 min，50℃退火45 s，72℃延伸1 min；30轮循环； 72℃再延伸5 min；4℃保存。PCR产物经电泳检测后送上海英潍捷基生物技术有限公司纯化后进行双向测序。

1.2.3 数据分析

序列的拼接和相似度分析使用DNAMAN软件进行，结合测序峰值图进行正反链的拼接校对，将拼接好的序列在BOLD SYSTEM系统中进行序列同源性搜索，以明确已测定序列是否为目标序列片段。采用Mega7软件[21]计算和分析遗传距离。

2 结果与分析

2.1 虫体鉴定结果

鉴定主要参考《中国经济昆虫志第55册：缨翅目》[22]、Masumoto & Okajima[23]以及Li等[4]对喙蓟马属Mycterothrips的修订与研究，通过形态特征观察、模式标本核对，本文鉴定该蓟马种类为贡山喙蓟马Mycterothrips gongshanensis（Li, Li & Zhang），其形态特征和种类鉴定结果记录如下：

贡山喙蓟马（Mycterothrips gongshanensisLi,Li & Zhang, 2017）。雌虫体长1.1 ～ 1.3 mm。体棕褐色至黑褐色；前翅暗褐色，基部和端部色淡（图2-G）。头部眼后有横纹，单眼前鬃略短于单眼侧鬃，单眼间鬃位于后单眼前内缘，长度超过前单眼侧鬃的2倍（图1-D）；触角8节，节I具有1对背顶鬃，节III和节IV具有叉状感觉锥（图1-A）；前胸背板宽大于长，具有2对长的后角鬃，后缘鬃2对且内鬃I稍长于内鬃II（图1-D）；中胸背板具横纹，前缘感觉孔存在（图1-E）；后胸背板前中部具横纹，两侧具纵纹，中对鬃位于前缘上，无感觉孔（图1-E）；中、后胸内叉骨均具有明显的刺（图1-I）；前翅前脉鬃具有长的间断，端鬃2根，后脉鬃完整，翅瓣鬃5+1根；腹部背板节II ～ VIII两侧具横纹，横纹上有大量微毛，节VIII具有完整的后缘梳，腹部腹板无附属鬃，节II具有2对后缘鬃，节III ～ VII具有3对后缘鬃，节VII后缘鬃位于后缘之前（图1-F、图1-G、图1-K）。

雄虫体长0.9 ～ 1.1 mm。体色较雌虫淡（图2-H）；触角第6节几乎与雌虫等长（图1-A、图1-B）；腹部背板节VIII具有完整的后缘梳，节IX具有1对感觉孔和2对深色的刺状鬃（图1-H）；腹板节II无附属鬃，节III ～ VIII有8根附属鬃（图1-L）。

图1 贡山喙蓟马玻片标本形态图Figure 1 Morphological characteristics of slide specimen of M. gongshanensis

观察标本：8♀♀2♂♂，贵州贵阳黔中茶园，2014. X. 28，吕召云采；14♀♀4♂♂，贵州贵阳黔中茶园，2015. III. 15，吕召云、孟泽洪采；32♀♀8♂♂，贵州惠水长岩，2018. VII.30，孟泽洪、杨春、周玉锋采；1♀1♂，贵州惠水长岩，2019. IV. 22，李帅采；6♀♀1♂，贵州水城龙场镇，2019. IX. 4，李帅采；8♀♀2♂♂，贵州水城顺场乡，2019. IX. 4，李帅采；12♀♀3♂♂，贵州六枝，2019. IX. 6，李帅采；18♀♀2♂♂，贵州兴义天沁茶叶基地，2019. IX. 15，李帅采。

2.2 各虫态特征

卵（图2-A、图2-B）：乳白色，半透明，肾形，长 201 ～ 282 μm，宽 99 ～ 118 μm，近孵化时出现2个红色眼点。

1龄若虫（图2-C）：初孵时乳白色，后转为淡黄绿色，长354 ～ 607 μm，宽119 ～ 140 μm，头部长37 ～ 65 μm，触角向前平伸，无翅芽。

2龄若虫（图2-D）：黄绿色，长708 ～1016 μm， 宽 171 ～ 199 μm， 头 部 长 65 ～ 92 μm，触角向前平伸，无翅芽。

3龄若虫（伪蛹）（图2-E）：头胸部黄白色，腹部黄色，足和触角白色透明，体长731 ～911 μm，宽 165 ～ 265 μm，头部长 62 ～ 92 μm，翅芽开始显露，筒状，无毛，后翅长于前翅，触角直立或向后贴于头部背面。

4龄若虫（蛹）（图2-F）：最初通体黄白色，足、触角、翅白色透明，体长787 ～ 1120 μm，宽 224 ～ 287 μm，头部长 79 ～ 102 μm，翅芽逐渐伸长并显露毛序，前翅和后翅几近等长，触角向后贴于头部背面，随着生长发育的进程，翅与触角颜色先变暗，逐渐全体变棕褐色。

图2 贡山喙蓟马全虫态特征图Figure 2 The whole insect stages morphology of M. gongshanensis

2.3 线粒体COI序列

贡山喙蓟马M. gongshanensis所测双向序列经拼接后去掉两端引物序列得到15个样本序列长度均为655 bp，序列相似度高为99.84%，变异位点数3个。序列平均碱基组成情况为：T（39.2%）、C（18.2%）、A（30.0%）、G（12.6%），具较明显AT偏向性。所获序列在BOLD系统中进行初步比对，与其序列同源性最高的为喙蓟马属Mycterothrips的种类（88.5%），证明所测片段为目标序列。对实验获取的DNA条形码序列的遗传距离分析（Kimura 2-parameter distances）结果发现，毛腹喙蓟马6个地理种群的15个样本种内遗传距离极小，为0.00% ～0.46%（表2）。

表2 基于Kimura 2P的贡山喙蓟马种内遗传距离Table 2 Intraspecific genetic distance of M. gongshanensis based on Kimura 2P

3 结论和讨论

本文鉴定了一种广泛发生于贵州茶园的重要蓟马害虫——贡山喙蓟马M. gongshanensis，该虫形态特征与另一种茶树蓟马毛腹喙蓟马M.setiventris非常相似，但可从以下特征进行区分：（1）贡山喙蓟马前翅仅基部和端部色淡，而毛腹喙蓟马前翅中部常具一浅色域；（2）贡山喙蓟马后胸背板中对鬃位于前缘上，毛腹喙蓟马后胸背板中对鬃靠近；（3）贡山喙蓟马雄虫阳基腹突端域并不膨大且腹部背板节IX后缘具1对非常小的结节而非粗的SB1鬃[4]。生产实践中人们往往无法通过玻片标本特征对害虫进行识别，本文提供了贡山喙蓟马的各虫态生态照片，方便对该虫进行初步鉴定。

除形态鉴定外，线粒体COI序列片段亦可辅助鉴定蓟马种类[24-26]。本文提交了贡山喙蓟马M. gongshanensis的线粒体COI数据（MT367384～ MT367392，MW288286 ～ MW288291）， 为该蓟马的分子鉴定以及遗传多样性研究提供了原始的分子数据参考。一般来讲，2%的遗传距离被认为是种间和种内差异的一个界限[20]，本文中6个地区贡山喙蓟马M. gongshanensis的15个样本种内最大差异值（0.46%）远小于界限值，且经核实，本文提交的贡山喙蓟马M.gongshanensis的DNA条形码数据与其模式标本完全吻合，说明数据真实有效。由于目前世界上已公布的关于喙蓟马属昆虫的分子遗传信息极少，因此仅用线粒体COI序列不足以作为该虫的鉴别依据。

此外，贡山喙蓟马除形态特征与毛腹喙蓟马相近外，二者发生为害特点也有许多共同点：均喜为害茶树未展开或部分展开的芽头，受害幼嫩芽叶正面褐化甚至芽头脱落，每年9 ～ 10月份为害最为严重等[4,27]。

在对贡山喙蓟马的首次分类记述中，该害虫就被认为可能是茶园一个潜在的害虫[4]。通过近年来的调查，我们证实了其在贵州的广泛分布并认为该虫是贵州茶园一种重要吸汁性害虫。鉴于该害虫在贵州省的发生和为害现状，亟待开展其在我国其它茶区的分布与为害情况调查、生物学与生态学特性、防治技术等方面的深入研究。