一株阴沟肠杆菌的分离、鉴定与发酵条件优化

彭琳，刘幸红，刘丙花，齐英杰，亓玉昆，马海林，刘方春，牟相芹，付刚锋

（1.山东省林业科学研究院，山东 济南 250014；2.金正大生态工程集团股份有限公司，山东 临沂 276700；3.山东省林业科技培训中心，山东 济南 250013；4.山东新超农业科技有限公司，山东 聊城 252000）

植树造林是改良盐碱地的生物措施之一，不但可以改善环境，抑制土壤盐碱化［1］，而且可以直接利用盐碱地生产林木，提高盐碱地的生产能力和经济效益［2］。但是，盐碱地人工林普遍存在着生产力低下、大面积衰退现象，导致林业生态服务功能弱化［3］。大量研究表明：深层土壤盐分含量高、林地土壤肥力差是造成盐碱地人工林退化的主要原因［4］。

利用微生物改良盐碱土成为近年来的研究热点［5］。研究表明：盐生植物根际促生细菌能够改善土壤微生物区系，提高微生物活性，降低土壤盐碱度，提高养分利用率，促进土壤有机质的合成，增加土壤速效养分，调节植物生长，增强植物耐盐碱能力，盐生植物根际促生细菌在低肥力的盐碱地中表现出重大的应用潜力［6－8］。

本研究从白蜡（Fraxinus chinensis）根际土壤中［9］筛选获得一株耐盐碱效果突出的菌株TIA062，并对其进行了鉴定。为了进一步降低其发酵成本、提高应用价值，对其发酵培养基成分与发酵条件进行优化，为后期推广应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤样品及处理 在山东省东营市黄河三角洲白蜡种植园内，利用采样器在土壤表层5 cm处用多点混样法［10］采集白蜡根际土样10个，放入无菌自封袋中密封。所有样品做好标签并于4℃冰箱储存备用。

1.1.2 化学试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 培养基 LB固体培养基：蛋白胨10.0 g／L，酵母粉55.0 g／L，NaCl 10.0 g／L，琼脂粉20.0 g／L，pH值为7.0～7.2。121℃灭菌20 min。

LB液体培养基：蛋白胨10.0 g／L，酵母粉5.0 g／L，NaCl 10.0 g／L，pH 值为7.0～7.2。121℃灭菌20 min。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：蛋白胨10.0 g／L，NaCl 50.0 g／L，牛肉膏3.0 g／L，琼脂20.0 g／L，pH＝7.4。121℃灭菌20 min。

1.1.4 仪器与设备 TU－1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；LRHS－250F－Ⅱ型恒温恒湿培养箱，上海龙跃仪器设备有限公司；BCL－1360B型超净工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；THZ－C－1型恒温振荡器，常州市国旺仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株筛选 通过三区划线法、小麦叶片保绿法和萝卜子叶增重法［11］，结合细菌形态和生理生化特征测定［12］，从白蜡根际土壤样品中筛选获得一株耐盐碱效果突出的菌株，编号TIA062，接于LB斜面上保存备用。

1.2.2 菌株鉴定 使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取TIA062菌株的总DNA，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将16S rDNA基因序列上传至美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库获得登录号，并将其序列于NCBI中进行比对，使用MEGA 5.0构建系统发育树，进行系统发育树分析［13］。

1.2.3 种子液制备及生长曲线测定 将TIA062接于LB固体平板培养基上进行活化，37℃条件下培养18 h。于活化平皿中挑取一环接种至装液量为50 mL（250 mL三角瓶）的LB液体培养基中，37℃、180 r／min摇床振荡培养20 h，备用。

生长曲线的测定［13］：取活化后TIA062一环接种至装液量为30 mL（250 mL三角瓶）的LB液体培养基中，37℃、180 r／min摇床振荡培养，每2 h取一次样，测定发酵液在波长600 nm条件下的OD值，并绘制菌株的生长曲线。

1.2.4 培养基成分优化 （1）单因素试验：菌株培养的基础条件为：以1%的接种量将种子液接种至LB液体培养基中，装液量40%（V／V），置于37℃、180 r／min摇床上培养20 h，每个处理设4个重复。固定其他元素不变，分别用不同碳源、氮源、无机盐替换基础培养基中的碳源、氮源及无机盐。替换碳源及添加量为：3%的玉米淀粉、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖；替换氮源及添加量为：2%的酵母膏、蛋白胨、豆粕、硝酸钠；替换无机盐及添加量为：0.3%的KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCO3。

（2）正交试验优化：利用单因素试验找出最佳碳源、氮源和无机盐后，设计正交试验，进一步确定最佳配比［14］。正交试验水平设计如表1所示。

表1 L9（34）正交试验因素与水平

1.2.5 发酵条件优化 （1）pH试验：分别选取6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5作为培养基初始值，按5%接种量将菌液接种到已调pH的100 mL培养基中，37℃、180 r／min摇床培养18 h后测定OD600值。

（2）转速试验：分别选取90、120、150、180、210 r／min作为摇床转速，按（1）结果调节培养基初始值，将菌液接种到种子培养基中，37℃摇床培养18 h后测定OD600值。

（3）温度试验：选取28、32、37、41、45℃作为摇床温度，按（1）、（2）结果调节发酵液初始pH值和转速，将菌液接种到种子培养基中，摇床培养18 h后测定OD600值。

（4）接种量试验：选择1%、2%、3%、4%、5%共5个接种量梯度，按（1）、（2）、（3）结果调整初始pH 值、转速和温度，摇床培养18 h后测定OD600值。

（5）装瓶量试验：选择50、75、100、125、150 mL（250 mL三角瓶）装液量梯度，按（1）、（2）、（3）、（4）结果调整初始pH值、转速、温度和接种量，摇床培养18 h后测定OD600值。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

由图1可知，TIA062菌落圆形规则，较小，表面凸起较湿润，呈微黄色，不透明。菌体较小，短杆状，无芽孢。其生理生化特性见表2。

图1 TIA062菌落和菌体形态

表2 TIA062生理生化特性

2.2 菌株的鉴定

TIA062菌株16S rDNA与NCBI数据库序列比对结果显示，其与Enterobacter cloacae同源性达98.97%；系统发育树（图2）表明，TIA062与Enterobacter cloacae处于同一分枝，结合菌落形态和生理生化特征将其鉴定为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）。

图2 TIA062基于16SrDNA基因序列构建的系统发育树

2.3 菌株生长曲线

由图3可知，0～2 h为延迟期；从第4 h开始进入对数生长期，菌体生长迅速，浓度快速升高；18～24 h生长速度逐渐减小至平缓。因此，选择培养16～18 h的菌体作为种子液。

图3 阴沟肠杆菌TIA062的生长曲线

2.4 培养基成分优化

所选4种碳源的发酵菌液涂布后结果（表3）显示，以玉米淀粉为碳源的发酵菌液中菌落数量最多；其次是蔗糖、葡萄糖；可溶性淀粉效果较差，因此选用玉米淀粉作为碳源。所选4种氮源的发酵菌液涂布后结果（表4）显示，以蛋白胨为氮源的发酵菌液菌落数量最多；其次为酵母膏；硝酸钠、豆粕较差，因此选用蛋白胨作为氮源。所选4种无机盐的发酵菌液涂布结果（表5）显示，Ca-CO3为最佳无机盐选择。

表3 碳源优化

表4 氮源优化

表5 无机盐优化

2.5 正交试验分析

以玉米淀粉（A）、蛋白胨（B）、CaCO3（C）为因素，按L9（33）正交表设计3因素3水平的正交试验，以菌落总数作为指标，确定培养基中各组分的最佳用量［15］。结果（表6）表明，最佳水平组合为A1B2C2。方差分析结果表明，因素B 对TIA062生长的影响显著。因此，确定培养基配方为玉米淀粉1%、蛋白胨1.5%、CaCO30.3%。

表6 正交试验分析

2.6 发酵条件优化

在确定培养基配方的基础上，通过单因素试验对发酵条件进行了优化。结果（图4）表明，一定范围内单位体积发酵液的OD600值随着装瓶量的增大、培养温度的上升、转速的加快、接种量的增多而增加。pH过高或者过低，都会抑制菌的正常生长；转速太慢，溶氧量不足，转速太快会造成细胞破裂；接种量太大，细菌衰退期提前，接种量太少，延迟期时间增加。综上所述，培养基pH＝7.0、装瓶量100 mL（250 mL三角瓶）、培养温度37℃、转速180 r／min、种子液接种量3%为TIA062菌株最佳发酵条件，在此条件下，TIA062的菌落数为1.325×1011cfu／mL。

图4 不同培养条件对TIA062生长的影响

3 讨论与结论

生长培养基不仅为菌株提供生长和繁殖所需的营养物质，更是其合成代谢产物的基础，因此培养基的组分对菌株生长及活性物质的产生至关重要［16］。筛选出最佳碳源、氮源、碳氮比，及适宜的发酵条件（如pH、温度、培养时间、通气量和接种量等）是发酵的重要环节［17］，这些因素相互促进与制约。因此，需要对营养条件和发酵条件的各种因子进行优化分析。培养条件的优化通常采用正交试验或响应曲面法［18］，大多应用于微生物酶活性的提高、分泌抗生素或抗菌蛋白等有益产物等方面［19，20］，而在根际促生菌的培养条件优化方面研究较少。

本研究的单因子试验结果显示，玉米淀粉作为碳源、蛋白胨作为有机氮源、CaCO3作为无机盐最有利于TIA062的生长。优化发酵条件试验结果表明，菌株最适发酵条件为pH＝7.0、温度为37℃、250 mL三角瓶装液量100 mL、3%接菌量、转速为180 r／min。本试验为该菌株的进一步推广应用及促生机制的研究奠定了基础。