HIF-1α转染脂肪干细胞复合HA/β-TCP 人工骨修复兔股骨头坏死模型的实验研究

戴明华 华筠毅 张贵宝 徐华年 吴洪亮

(上海市浦东新区浦南医院，骨科 上海 200125)

股骨头坏死(ONFH)也可称之为股骨头缺血性坏死，是源于多种因素引起股骨头部血液供应障碍，进而引发股骨头关节功能障碍、股骨头塌陷等多种骨科疑难病[1-2]。随着我国人口老龄化逐渐增加，ONFH的发病率也随之上升，故受到人们广泛关注[3-7]。羟基磷灰石/β-磷酸三钙(HA/β-TCP)构成的复合材料是公认的性能良好的骨修复替代材料。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在骨再生时成骨和成血管的偶联反应中发挥重要作用，是一个细胞对缺氧环境的反应调节的关键因子[8]。本研究采用HIF-1α转染脂肪干细胞复合HA/β-TCP人工骨修复兔股骨头坏死模型，探讨其在骨头坏死中的治疗效果。报告如下。

1 材料与方法

1.1实验材料 健康新西兰白兔45只，平均体重2.5 kg(2.2～2.8 kg)，其中45只共90侧股骨头分5个组，其中A-D组每组各10只，E组5只。从兔耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素(LPS，美国sigma公司)50 g/kg，2次。与此同时，进行臀肌注射甲基泼尼松40 mg/kg，共3次，每日1次。所有动物每周臀部注射青霉素20万U。最后一次注射后6周，使用3%的戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉动物，将动物俯卧位放置，行磁共振检查证实动物股骨头内出现骨坏死。

1.2实验方法 模型制作成功后，将实验动物分为5组：A组为采用髓芯减压术后植入HIF-1α转染脂肪干细胞复合HA/β-TCP人工骨。使用3%的戊巴比妥钠麻醉后，俯卧在手术台上，双侧股骨近端剃毛，1%活力碘消毒铺巾。以股骨大转子为中心做3 cm左右的纵形皮肤切口，切开深筋膜，暴露大转子和周围的肌肉，向内侧分离附着在大转子后方的肌肉，并暴露骨组织。用直径1 mm的钻头经大转子后下方与股骨长轴成135°向股骨头内钻孔，同时用C臂机透视，确保钻头进入股骨头坏死病灶内。A组为植入HIF-1α转染脂肪干细胞复合HA/β-TCP人工骨；B组植入脂肪干细胞复合HA/β-TCP人工骨；C组植入HA/β-TCP人工骨；D组植入脂肪干细胞；然后用凝胶海绵封闭隧道，肌肉覆盖隧道口，逐层缝合。术后3d，每d注射庆大霉素8万单位预防感染。E组不做手术，为空白对照组。于术后2、4、6、8、12周后，分别取出各组2只兔子，其中E组仅取1只，剃除胸部和腹部毛发，仰卧位固定在手术台上，3%的戊巴比妥钠麻醉后，1%活力碘消毒铺巾。腹部正中切口，切开皮下组织和肌肉，打开腹腔，结扎腹主动、静脉的近心端。将静脉留置针插入远心端的腹主动脉，并固定牢固。剪开远心端的腹主静脉，使用含有肝素的生理盐水缓慢灌注，直至流出的液体完全透明。腹主动脉注射20ml Microfil工作液，严格按照Microfil的说明书进行配置，随后将动物放置在4℃的冰箱过夜。第2天，取出动物的双侧股骨近端，标记后，放置在4%多聚甲醛中保存。观察指标：(1)X线摄片、CT扫描：术后2、4、6、8、12周各组兔摄双侧髋关节X线正位片及CT扫描，观察股骨头形态和髋关节情况。X 线检查，参照Lane-sandhu X线评分法对骨修复情况进行评分，该评分包括骨形成、骨连接、骨塑形，共计11项，总分12分，分数越高表示骨修复情况越好。(2)修复区内骨形态计量分析：将术后四个时间段各组所有组织块进行连续切片，系统选片，每块组织选5张。在放大100倍条件，每张切片上系统随机选取5个视野，在图像分析仪下进行组织形态分析，测定术后新生骨小梁厚度。

2 结 果

2.1骨修复评分 A组在术后2周、4周、8周、12周的骨修复评分上均比B组、C组、D组、E组高(P<0.05)。见表1。

表1 骨修复评分(分)

2.2术后骨小梁厚度 A组在术后2周、4周、8周、12周的骨小梁厚度上均比B组、C组、D组、E组高(P<0.05)。见表2。

表2 术后骨小梁厚度(um)

3 讨 论

近年来，ONFH发病率逐年呈上升趋势，该疾病属于现阶段骨科中最常见的难治性疾病，若未予以早期、对症治疗，可诱发不同程度的塌陷，造成髋部持续性疼痛，且关节功能受到一定限制，进而对患者生活质量、生命健康构成严重威胁[9-10]。为了更好的研究ONFH，国内外很多学者采用各种法在动物身上建立ONFH病的模型。

纳米相羟基磷灰石/胶原骨为细胞提供了天然骨类似的微环境，有助于骨系细胞的黏附、增殖及功能发挥。与骨组织结合后促进骨的生长，而且其形态比较稳定，抑制部分肿瘤细胞生长的同时对正常细胞没有毒性作用[11-12]。本次研究结果表明，A组在术后2周、4周、8周、12周的骨修复评分上均比B组、C组、D组、E组高，差异有统计学意义(P<0.05)，A组在术后2周、4周、8周、12周的骨小梁厚度上均比B组、C组、D组、E组高，差异有统计学意义(P<0.05)，分析原因：HIF-1α是血管内皮生长因子(VEGF)的上游基因，HIF-1α过表达能够增强VEGF在脂肪干细胞中的分泌，诱导新生血管的形成。另外，HIF-1α还能够增强基质细胞源性细胞因子(SDF-1)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、血管生成素2(ANGPT2)、胎盘生长因子(PLGF)、干细胞因子(SCF)等因子的分泌，多种因子共同作用能够更好的促进形成完整的新血管。

综上所述，HIF-1α转染脂肪干细胞复合HA/β-TCP人工骨修复有明显的修复能力，可保持较好的股骨头外形，促进骨化程度的修复，移植物与宿主骨整合较好，并可提升骨小梁厚度，治疗效果显著。