基于MAPK/ERK信号通路探讨当归多糖 对脑缺血再灌注损伤大鼠的影响

汤定中 余春丽 罗国君△

(上海市第六人民医院金山分院 1.神经内科;2.肾病科 上海 201599)

脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)是脑血流不足或中断致脑组织缺血缺氧一段时间，之后血供恢复，以脑组织损伤程度和功能障碍反而加重为主要特征的复杂病理现象[1]。该病的临床表现主要为感觉、运动或意识严重障碍等。CIRI是大部分缺血性脑血管病的重要病理生理过程，近年来，随着缺血性脑血管病发病率逐年增加，CIRI发生的几率也不断升高，并且拉高了脑血管病患者的残疾率、死亡率[2]，对患者生命健康造成严重威胁。目前，CIRI治疗中常用的脑保护药物为麻醉药物、他汀类药物、N-乙酰半胱氨酸、阿片类物质、磷酸肌酸、蛋白酶抑制剂等等[3]，它们通过不同途径对脑损伤起到一定的改善作用，但尚无特效药物。明确各种药物的作用靶点及疗效，开发新的脑保护药物是该病的研究重点，而中医药是CIRI新药研发的主要来源之一[4]。当归多糖为中药当归的主要活性成分，林国芳等[5]研究发现，当归多糖可能通过抑制神经元凋亡对CIRI大鼠发挥神经保护作用，但具体作用机制不明确。本次研究主要基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路，探讨当归多糖对CIRI模型大鼠的影响。报告如下。

1 资料与方法

1.1材料 (1)研究对象：6～7周SPF级健康SD大鼠65只，均为雄性，体重250～280g，平均(263.46±9.54)g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(苏)2016-0010。将所有大鼠每笼5只置于饲养室内进行为期5 d的适应性饲养，温度设定为24℃～26℃，相对湿度维持在50%～70%，光照时间6:00～18:00，大鼠在笼内自由活动并摄入标准颗粒饲料及清洁饮水，定期清扫鼠笼并消毒。(2)主要药品与试剂：当归多糖，纯度≥98%，货号：s31086，规格：每瓶25 g，购自苏州瑞诺德生物科技有限公司，使用时采用蒸馏水配制成浓度为3 mg/mL、6 mg/mL的当归多糖溶液，现用现配。尼莫地平片，规格：每片20 mg，批号：20180613，购自亚宝药业集团股份有限公司，使用时用蒸馏水配制成浓度为1.5 mg/mL的尼莫地平混悬液，现用现配。PBS、TBST缓冲液，购自北京华迈科生物技术有限责任公司；末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧尿三磷酸(dUTP)缺口末端标记测定法(TUNEL法)细胞凋亡检测试剂盒，购自上海恒斐生物科技有限公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒，购自北京百奥莱博科技有限公司；大鼠B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)酶联免疫分析(ELISA)检测试剂盒，购自武汉菲恩生物科技有限公司；RIPA组织裂解液，购自北京碧橙蓝生物科技有限责任公司；兔抗磷酸化原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1(p-Raf1)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶2(p-MEK2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体，购自北京孚博生物科技有限公司；羊抗兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶标记抗体)，购自上海恒斐生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺 (SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒，购自金克隆(北京)生物技术有限公司；ECL化学发光检测试剂盒，购自爱必信(上海)生物科技有限公司。(3)主要仪器设备：ID-Centrifuge 12 S II型离心机，瑞士DiaMed GmbH公司产品；EM-3000型光学显微镜，日本多美公司产品；SUNRISE型酶标仪，瑞士TECAN公司产品；GeneQuant Pro型超微核酸蛋白检测仪，美国GE公司产品；HYDRASYS 2型全自动电泳仪，法国SEBIA公司产品；Trans-Blot型转膜仪，美国BIO-RAD公司产品。

1.2方法 (1)造模及实验方法[6]：适应性饲养完成后，将所有大鼠依照随机数字表法分为对照组12只和造模组53只。腹腔注射4%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，仰卧位固定于小动物手术台上，颈前右侧常规备皮消毒，于颈正中线右侧旁开0.5 cm处作纵向切口，逐层分离组织，暴露右颈总动脉，分离右颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)及翼腭动脉(PPA)，造模组用4号手术线将ECA远心端和PPA近心端结扎，动脉夹夹闭CCA、ICA，于距离ICA和ECA交叉部4 mm的ECA结扎处剪“V”形切口，长度为0.2 mm左右，并将4号手术线穿过交叉部3 mm内；“V”形切口内插入2-0尼龙鱼线，去掉夹闭ICA的动脉夹，将线栓(2-0尼龙鱼线头端5 mm用石蜡包被，且标记18 mm处)依次经ECA-ICA和ECA交叉部-ICA-大脑前动脉(ACA)、中动脉(MCA)分叉处插入16 mm～18mm，阻断MCA入口，切口外留线栓1 cm左右；将ECA远心端结扎并固定线栓；对照组仅分离动脉，不进行栓塞；去掉夹闭CCA的动脉夹，缝合皮肤；2 h后，轻轻拉出线栓，感受到阻力时剪断，将ECA近心端结扎；于伤口注射青霉素2.5 mg/kg以防止染。待大鼠清醒且生命体征稳定后，采用Zea longa神经功能缺失评分[6]评估大鼠神经功能，评分为1～3分即认为脑缺血再灌注损伤模型建立成功。将造模成功的48只大鼠随机分为模型组、西药组及当归多糖低、高剂量组，各12只。模型组、对照组分别灌胃给予蒸馏水10 mL/kg，每日1次；西药组灌胃给予1.5 mg/mL尼莫地平悬液10 mL/kg，每日1次；当归多糖低、高剂量组分别灌胃给予3 mg/mL、6 mg/mL当归多糖溶液10 mL/kg，每日1次。所有大鼠连续给药7 d。(2)神经功能缺损评分评估：末次给药次日，采用Zea Longa评分标准对大鼠神经功能进行评分：无神经功能缺损记0分；提尾时左侧前肢伸展不完全记1分；自发行走时向左侧转圈记2分；自发行走时向左侧跌倒记3分；意识丧失，不能自发行走记4分。(3)标本采集与处理[7]：麻醉后于冰上断头取脑，自缺血侧脑组织重分离海马组织，其中1/2液氮速冻后保存于-80℃冰箱内，以备蛋白质免疫印迹(Western blot)检测；另外1/2海马组织加入10倍体积预冷的生理盐水，充分匀浆后，以3 000 r/min速度离心15 min，将组织上清液保存在-70 ℃冰箱内。剩余缺血侧脑组织置于4%多聚甲醛内固定48 h，经二甲苯透明、梯度酒精脱水、石蜡包埋后，制备2 μm切片，于冷水内展片放于载玻片上，65℃烘干1 h，4℃保存备检。(4)TUNEL法检测大鼠缺血侧脑组织凋亡细胞数[8]：将(3)中制备的组织切片取出，恢复至室温，采用二甲苯脱蜡10 min×2 次，100%-100%-95%-95%-80%-80%-70%-70%酒精依次处理5 min，然后去离子水冲洗2 min×3 次使切片水化；采用终止液50 mL处理切片5 min使内源性过氧化物酶失活，去离子水冲洗2 min×3 次；按照试剂盒说明书配制TUNEL反应液，取50 μL处理切片，37 ℃反应5 min后终止，PBS冲洗2 min×3 次；取HRP标记链霉亲和素溶液50 μL处理切片，18 ℃反应10 min后，PBS冲洗2 min×3 次；采用DAB显色试剂盒室温染色6 min，去离子水漂洗10 s后，用甲基绿溶液染色3 min；依次采用去离子水漂洗、70%-90%-95%-95%-100%酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。在光学显微镜下观察染色结果，凋亡阳性细胞的细胞核呈棕色，于400倍镜下，每张切片随机选择5个不重复视野，计数凋亡细胞个数，并取平均值。(5)ELISA法检测大鼠海马组织Bcl-2和Bax水平[9]：将1.2.3中制备的海马组织上清液取出，4℃缓慢融化并恢复至室温，按照ELISA试剂盒说明书，采用SUNRISE型酶标仪测定海马组织上清液内Bcl-2和Bax水平。(6)Western Blot法检测大鼠海马组织p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表达水平[8]将(3)中保存的海马组织取出100 mg，置于玻璃匀浆器内，加入RIPA组织裂解液(含苯甲基磺酰氟)1 mL，于冰上匀浆30 min，超声裂解5 s×3次，4℃、12000 r/min速度离心5 min，分离上清液，采用超微核酸蛋白检测仪测定总蛋白浓度；取蛋白样本，加入2×蛋白上样缓冲液10 μL，煮沸5 min，冷却备用；按照试剂盒说明配制SDS-PAGE10%分离胶和5%浓缩胶，注入电泳仪上；上样，开始电泳，电压为浓缩胶80 V、分离胶120 V；采用转膜仪将目的蛋白条带转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，TBST洗膜10 min×3次；PVDF膜置于5%脱脂奶粉封闭液内，室温摇床封闭1.5 h；PVDF膜置于p-Raf1(1：1 000稀释)、p-MEK2(1：1 000稀释)、p-ERK1/2(1：800稀释)、β-actin(1：2 000稀释)一抗工作液内,4℃孵育过夜，取出后TBST洗膜10 min×3次；将PVDF膜置于羊抗鼠二抗工作液(1:5 000稀释)内，室温孵育2 h，取出后TBST洗膜10 min×3次；采用ECL处理PVDF膜5 min后曝光。扫描曝光后的底片，用Quantity one软件分析各蛋白条带灰度值，计算p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白相对于β-actin的表达量。

1.3统计学方法 所有统计数据均统一整理，采用spss22.0软件包分析，符合正态性的计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05存在统计学意义；组间多重比较采用LSD-t检验，P<0.05存在统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠神经功能缺损评分比较 与对照组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分明显较高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，当归多糖低、高剂量组和西药组大鼠神经功能缺损评分较低，且当归多糖低剂量组>当归多糖高剂量组和西药组，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

2.2各组大鼠缺血侧脑组织凋亡细胞数比较 TUNEL染色结果显示，对照组有少量凋亡细胞存在(见图1A)；模型组可见大量棕色凋亡细胞核(见图1B)；当归多糖低、高剂量组和西药组大鼠凋亡细胞数量较模型组有不同程度减少(见图1C、D、E)。定量分析显示，与对照组比较，模型组大鼠缺血侧脑组织凋亡细胞数明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，当归多糖低、高剂量组和西药组大鼠缺血侧脑组织凋亡细胞数均较低，且当归多糖低剂量组>当归多糖高剂量组和西药组，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表2。

表2 各组大鼠缺血侧脑组织凋亡细胞数比较

注：(A:对照组 B:模型组 C:当归多糖低剂量组 D:当归多糖高剂量组 E：西药组)图1 各组大鼠缺血侧脑组织凋亡细胞观察 (TUNEL染色，×400)

2.3各组大鼠海马组织Bcl-2和Bax水平比较 与对照组比较，模型组大鼠海马组织Bcl-2和Bax水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，当归多糖低、高剂量组和西药组大鼠海马组织Bcl-2水平均较高，且当归多糖低剂量组<当归多糖高剂量组和西药组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，当归多糖低、高剂量组和西药组大鼠海马组织Bax水平均较低，且当归多糖低剂量组>当归多糖高剂量组和西药组，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表3。

表3 各组大鼠海马组织Bcl-2和Bax水平比较

2.4各组大鼠海马组织 p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表达水平比较与对照组比较，模型组大鼠海马组织p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，当归多糖低、高剂量组和西药组大鼠海马组织p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表达水平均较低，且当归多糖低剂量组>当归多糖高剂量组和西药组，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表4，图2。

表4 各组大鼠海马组织p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表达水平比较

注：(A:对照组 B:模型组 C:当归多糖低剂量组 D:当归多糖高剂量组 E：西药组)图2 Western Blot法检测各组大鼠海马组织海马组织 p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表达结果

3 讨 论

有报道称[10-12]，MAPK途径在脑、心脏等重要器官缺血再灌注时活化，在细胞凋亡诱导中发挥关键作用，改变其活化状态有助于减轻组织损伤。

在此次研究中，我们即基于MAPK/ERK信号通路，探讨当归多糖对CIRI大鼠的影响。当归多糖是中药当归中的额水溶性多糖物质，包括葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等，药理研究认为[13]，其具有调节免疫功能、促进造血、抗肿瘤、保肝、抗氧化、抗辐射、防治肺纤维化、抗衰老等多种功效。闫安等[14]采用不同剂量的当归多糖对线栓法制备的CIRI模型大鼠进行干预，发现其能通过减少脑组织氧化应激水平，以及抑制炎症相关信号通路Toll样受体-4/核转录因子-κB(TLR-4/NF-κB)激活的作用保护大鼠脑组织。方针等[15]研究则发现，当归多糖能明显促进CIRI大鼠模型的神经功能恢复和血管生成。由此可见，当归多糖可通过不同机制干预CIRI进展。在本研究中，我们采用大脑中动脉阻塞法成功建立了CIRI大鼠模型，分别经不同浓度的当归多糖和尼莫地平治疗后发现，与模型组比较，各用药组大鼠神经功能缺损评分较低，且当归多糖低剂量组>当归多糖高剂量组和西药组，差异有统计学意义(P<0.05)，Zea Longa评分是评估神经功能缺损程度的常用指标，得分越高，提示神经功能缺损越明显，病情越严重，上述研究结果表明当归多糖可以有效改善CIRI大鼠神经功能障碍，缓解病情，且药物剂量越高，作用效果越明显。TUNEL检测结果显示，与模型组比较，各用药组大鼠缺血侧脑组织凋亡细胞数均较低，且当归多糖低剂量组>当归多糖高剂量组和西药组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明高剂量当归多糖能有效抑制神经细胞凋亡，减轻缺血侧脑组织损伤。MAPK/ERK信号通路是MAPKs通路的一种类型，为调控细胞凋亡的常见通路。本研究结果显示，与模型组比较，各给药组大鼠海马组织海马组织Bcl-2水平较高，BAX及p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表达水平均较低，且当归多糖高剂量组和西药组改变较模型组最明显，差异有统计学意义(P<0.05)，表明高剂量当归多糖可以有效下调海马组织p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表达，进而提高海马组织Bcl-2水平，降低海马组织Bax水平，这可能是当归多糖抑制CIRI大鼠脑组织细胞凋亡的作用机制之一。

综上所述，当归多糖能剂量依赖性的减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损，调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax水平，抑制缺血脑组织细胞凋亡，其作用可能与下调MAPK/ERK信号通路中的p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表达有关。