鸡内金多糖对尖吻鲈幼鱼生长、消化、肠道抗氧化能力和血清生化指标的影响

曾祥兵，董宏标，韦政坤，段亚飞，陈 健，张 慧，孙彩云，许晓东，张家松

（1. 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300；2. 水产科学国家级实验教学示范中心 (上海海洋大学)，上海 201306； 3. 中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地，广东 深圳 518121； 4. 阳江市水产技术推广站，广东 阳江 529500；5. 珠海德洋水产养殖有限公司，广东 珠海 519000）

尖吻鲈 (Lates calcarifer) 属尖吻鲈科、尖吻鲈属，又名金目鲈、盲鰽，广泛分布于琉球至印度洋海域，具有生长快、广盐性、养殖成活率高、肉质鲜美、适应能力强等优点，颇受养殖户和消费者青睐[1-2]。广东珠三角地区是我国尖吻鲈主养区域，在追求集约化、高效益的同时亦伴随着诸多问题。高密度养殖系统中，由于较高的投放密度、单一的人工饲料投喂、较为简单的生态系统以及过低的环境承载力极易造成水质恶化、病害频发，其中消化道疾病一直是近年来的主要病症之一[3-6]。

天然中草药的多功能性、无毒副作用等优点使其作为水产饲料添加剂越来越受到重视[7]。鸡内金(Endothelium corneum gigeriae galli) 为脊索动物门雉科动物家鸡 (Gallus gallus domesticus) 的干燥砂囊内壁，即鸡的胃内膜，其富含蛋白质、氨基酸、多糖等生物活性物质，具有消食健胃、固精止遗和通淋化石等一系列药食两用功能[8-9]。鸡内金多糖(Polysaccharide from E. corneum gigeriae galli, PEGG)为鸡内金经一系列工艺提取而成，大量研究表明绝大多数天然多糖在抗氧化、抗衰老、降血脂、提高机体免疫力等方面疗效显著[10-13]。蒋长兴等[14]发现PEGG能够调节高脂血症大鼠 (Rattus norvegicus)的代谢紊乱，提高其机体脂代谢能力，改善血液流变学指标和缓解氧化应激水平。目前，有关PEGG在水产动物中的应用研究尚未见报道，本研究探讨了PEGG对尖吻鲈幼鱼生长性能、消化能力、肠道抗氧化能力和血清生化指标的影响，以期为PEGG在尖吻鲈健康养殖中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 饲料制备

实验所用PEGG购自湖北天门恒昌化工有限公司 (纯度35%)。基础饲料为鲈膨化配合饲料 (珠海海龙生物科技有限公司)，营养成分 [质量分数：粗蛋白质≥41.0%、粗纤维≤3.0%、粗灰分≤18.0%、总磷≥1.20%、粗脂肪≥5.0%、赖氨酸≥2.10%、钙 (Ca) 0.80%～4.00%、水分≤10.0%]。将 PEGG 溶于蒸馏水配置成母液，按 0、5、20和 80 g·kg−1PEGG设4个梯度，高压喷壶均匀喷涂于饲料表面，经30 ℃鼓风干燥箱完全烘干后，4 ℃冷藏备用。

1.2 实验设计与实验管理

实验鱼取得、暂养和实验开展均在广东珠海德洋水产养殖有限公司进行。实验鱼先于室内方形水泥池 (4 m×2.5 m×1 m) 中暂养 14 d，期间每天07:00和18:00饱食投喂2次基础饲料，日换水1次，换水率30%。暂养期间水温 (30±1) ℃、盐度≤3、溶解氧质量浓度≥7 mg·L−1、自然光周期。暂养结束后，随机选取体表无损伤、规格相近的健康尖吻鲈幼鱼[(11.85±1.66) g]共240尾，分为 4组，即对照组 (0 g·kg−1)、低剂量 (5 g·kg−1)、中剂量 (20 g·kg−1) 和高剂量组 (80 g·kg−1)。每组4个重复，每个重复15尾，养殖于16个玻璃纤维黑桶中 (300 L)。分别投喂对应剂量饲料，日投喂2次 (7:00和18:00)，日投饵量为鱼体质量的1%～3%，并根据实际情况进行调整。养殖实验持续8周，日常管理和环境参数与暂养期间相同。

1.3 样品采集

分别在第0、第4和第8周取样，取样前停喂1 d，每个重复组随机取1尾实验鱼，合计每个实验组共 4尾鱼。实验鱼经 200 mg·L–1MS-222浸泡麻醉后，测其体质量和体长，再经1.5 mL无菌注射器尾静脉取血，全血样品在4 ℃下静置1 h，待血液分层后，3 000 r·min–1离心 10 min，收集血清于1.5 mL离心管，−80 ℃保存。实验鱼采血后，置于冰盘上解剖，称量内脏团质量，取肠道和胃于 2 mL 离心管中，−80 ℃ 保存。

1.4 指标测定

1.4.1 生长性能指标测定 根据以下公式计算增重率 (WGR)、特定生长率 (SGR)、脏体比 (VSI)、肥满度 (CF)：

其中Wt、W0分别为实验尖吻鲈幼鱼的终末体质量和初始体质量，Wv为鱼的内脏团质量；t为实验天数 (56 d)；L为鱼体长 (cm)。

1.4.2 肠道组织切片制备及观察 肠道组织切片制作与HE染色参照魏杰等[15]方法进行。将肠道分为前、中、后3段于4%多聚甲醛中固定24 h，经流水冲洗、梯度乙醇脱水和二甲苯透明，然后进行石蜡切片，厚度为5～7 μm，HE染色，中性树脂封片，于显微镜观察并拍照后，测量皱襞长度、皱襞宽度和肌层厚度，每张切片随机选择5个以上的长直皱襞进行长度和宽度测量，取平均值为每个重复样品的测定值。肌层厚度测量与统计方法同上。

1.4.3 抗氧化指标和消化酶活性测定 肠道中超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、谷胱甘肽 (GSH)、总抗氧化能力 (T-AOC) 和丙二醛 (MDA) 及胃肠道中胃蛋白酶 (Pep)、胰蛋白酶 (Tryp)、脂肪酶 (LPS) 和淀粉酶 (AMS) 的测定均采用商业试剂盒 (南京建成生物工程研究所)，具体方法参照说明书。

1.4.4 血清生化指标测定 血清中总蛋白 (TP)、总胆固醇 (TC)、甘油三酯 (TG)、血糖 (GLU)、谷丙转氨酶 (ALT) 和谷草转氨酶 (AST) 等指标，采用商业试剂盒 (深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司) 全自动生化分析仪 (BS200) 检测。

1.5 数据统计与分析

2 结果

2.1 PEGG对尖吻鲈幼鱼生长性能的影响

与对照组相比，各处理组尖吻鲈幼鱼终末体质量、增重率和特定生长率均有升高。其中，高剂量组差异显著 (P<0.05)；中剂量组肥满度显著高于对照组 (P<0.05)。各处理组的脏体比均有提高，但无显著性差异 (P>0.05，表 1)。

表1 饲料中添加鸡内金多糖对尖吻鲈幼鱼生长性能的影响Table 1 Effect of dietary PEGG level on growth performance of juvenile L. calcarifer

2.2 PEGG对尖吻鲈幼鱼消化能力的影响

2.2.1 PEGG 对肠道组织形态的影响 与对照组相比，各处理组肠道完整性增加，肠绒毛排列更加完整致密，杯状细胞分布规律，且以中剂量组最佳(图1)；各处理组前中肠皱襞高度、前肠皱襞宽度和肌层厚度均显著增加，中剂量和高剂量组后肠皱襞高度和肌层厚度显著提高 (P<0.05，图2)。

图1 第8周饲料中添加鸡内金多糖对尖吻鲈幼鱼肠道组织形态的影响 (10×10倍)F. 前肠；M. 中肠；H. 后肠；V. 绒毛；GC. 杯状细胞；ML. 肌层Figure 1 Effects of dietary PEGG level on intestinal histological structure of L. calcarifer on 8th week (10×10 times)F. Foregut; M. Midgut; H. Hindgut; V. Villus; GC. Goblet cell; ML. Muscular layer

图2 第8周饲料中添加鸡内金多糖对尖吻鲈幼鱼肠皱襞长宽和肌层厚度的影响相同横坐标点上不同字母表示差异显著 (P<0.05)；后图同此Figure 2 Effects of dietary PEGG level on intestinal fold height, fold width and muscular thickness of L. calcarifer on 8th weekValues with different letters for the same abscissa point have significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.

2.2.2 PEGG 对消化酶活性的影响 与对照组相比，处理组尖吻鲈幼鱼胃组织消化酶活性均显著升高 (图3)。其中，低剂量组的Pep和胃LPS在第4周、中剂量组和高剂量组Pep和胃LPS在第8周显著升高 (P<0.05)；低剂量和中剂量组AMS活性在第4周显著高于其他组，各处理组AMS在第8周显著升高，以中剂量组最高 (P<0.05)。

图3 饲料中添加鸡内金多糖对尖吻鲈幼鱼胃消化酶活力的影响Figure 3 Effects of dietary PEGG level on gastric digestive enzymes of L. calcarifer

与对照组相比，各处理组尖吻鲈幼鱼肠道消化酶活性均有提升 (图4)，其中，低剂量和中剂量组Tryp在第4周显著升高，低剂量和高剂量组Tryp在第8周显著升高 (P<0.05)；低剂量和中剂量组AMS在第8周显著升高；各处理组LPS在第4周显著升高，低剂量和中剂量组LPS在第8周显著升高 (P<0.05)。

图4 饲料中添加鸡内金多糖对尖吻鲈幼鱼肠消化酶活力的影响Figure 4 Effects of dietary PEGG level on intestinal digestive enzymes of L. calcarifer

2.3 PEGG对尖吻鲈幼鱼肠道抗氧化能力的影响

与对照组相比，拌喂PEGG后各处理组尖吻鲈肠道中CAT、SOD、GSH-Px的活性、GSH的浓度和T-AOC较对照组均显著上升 (P<0.05)。其中，低剂量组SOD和高剂量组GSH-Px在第4周最高，随着PEGG添加量的增加，第4周中CAT、GSH、T-AOC和第8周中各抗氧化指标呈先增加后下降的趋势，其中中剂量组最高；低剂量和中剂量组MDA浓度较对照组显著降低(P<0.05，图 5)。

图5 饲料中添加鸡内金多糖对尖吻鲈幼鱼肠抗氧化能力的影响Figure 5 Effects of dietary PEGG level on intestinal antioxidant capacity of L. calcarifer

2.4 PEGG对尖吻鲈幼鱼血清生化指标的影响

各处理组的血清TC浓度显著低于对照组(P<0.05，表2)，其中以高剂量组最低；中剂量组ALT活性显著低于对照组 (P<0.05)；低剂量和中剂量组的AST活性显著低于对照组；低剂量和高剂量组的GLU浓度显著高于对照组；各组间TP和TG浓度无显著性差异 (P>0.05)。

表2 第8周饲料中添加鸡内金多糖对尖吻鲈幼鱼血清生化指标的影响Table 2 Effect of dietary PEGG level on serum biochemical indices of juvenile L. calcarifer on 8th week

3 讨论

多糖是由多个单糖通过糖苷键相连形成的大分子化合物，存在于动物、植物和微生物中。大量研究表明多糖具有促进鱼类生长的作用，饲料中添加一定的枸杞多糖能够显著提高黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco)[16]的增重率，添加黄芪多糖能够增加杂交鳢 (Channa maculate♀×C. argus♂)[17]的增重率和齐口裂腹鱼 (Schizothorax prenanti)[18]的生长性能。本研究中，各处理组的终末体质量、增重率和特定生长率均高于对照组，其中高剂量组差异显著 (P<0.05)，表明PEGG对尖吻鲈幼鱼生长性能具有一定的促进作用。

肠道的发育状况和完整性是肠道健康和消化能力的直观反映[19]。有研究表明，配合饲料会对鱼类肠道组织形态造成一定损伤[20-21]。本研究通过对肠组织形态的分析，发现对照组绒毛排列疏短，破损脱落，而各处理组尖吻鲈肠道完整性增加，肠绒毛和杯状细胞排列更加规律整齐，且肠道各部位的皱襞长度、皱襞宽度和肌层厚度均有不同程度改善。迟玉森等[22]发现鸡内金提取物能够促进小鼠肠道蠕动，说明PEGG可能通过促进消化，增加肠道蠕动，使得尖吻鲈肠道的皱襞和肌层厚度上升，从而增强鱼体肠道的消化屏障。

此外，饲料中的营养成分能够改变鱼类消化道中消化酶的特性和浓度[23]。刘成荣[24]发现枇杷多糖能够显著提升金鱼 (Carassius auratus) 消化酶活性；Chen和Zhang[25]发现在饲料中添加适量的海带多糖能够增加草鱼 (Ctenopharyngodon idella) 消化酶活性。本研究处理组胃中Pep、AMS、LPS活性和肠中Tryp、AMS、LPS活性均有提高，其中，中剂量组的消化酶活性提升最大 (P<0.05)，表明拌喂一定剂量的PEGG能够提高尖吻鲈幼鱼的消化能力，这可能与鸡内金中的活性物质如胃激素、类角蛋白和胃蛋白酶等[26]能够促进消化有关。

PEGG具有清除自由基、螯合Fe2+和抑制脂质过氧化的功能[27]。Xiong等[28]发现PEGG灌胃能够提升小鼠 (Mus musculus) 心肌组织中的SOD活性，同时降低MDA浓度；蒋长兴等[14]亦发现PEGG能够显著提升高脂血症大鼠的总抗氧化能力。SOD和CAT是抗氧化酶系统中的2种关键酶，较高的SOD和CAT活性水平意味着细胞具备较高的自由基清除能力[29-30]，MDA是脂质过氧化最主要的标志物[31]。本研究显示，低剂量和中剂量组肠道SOD的活性均显著高于对照组，各处理组CAT活性显著高于对照组 (P<0.05)，而低剂量和中剂量组MDA浓度显著低于对照组 (P<0.05)，说明PEGG可以消除肠道中的自由基并抑制脂质过氧化。GSH是细胞中重要的非酶抗氧化剂，可以中和自由基或氧化剂；GSH-Px也在清除自由基、活性氧 (ROS) 和减少脂质过氧化等方面发挥着重要作用[32-34]；T-AOC从总体上反映了机体对自由基和活性氧类物质抵抗能力。本研究中处理组GSH、GSH-Px和T-AOC显著高于对照组 (P<0.05)，表明PEGG可以提高尖吻鲈肠道的抗氧化能力。

血清生化指标是反映机体健康、营养和代谢的重要指标[35-36]。血清TC和TG浓度能够反映机体的脂类代谢程度[37]。蒋长兴等[14]发现PEGG灌胃能够降低高脂血症大鼠血清TG和TC的浓度。本研究中各实验组间TG浓度无显著差异，而拌喂PEGG组中血清TC浓度显著低于对照组，其中高剂量组最低 (P<0.05)，表明PEGG对尖吻鲈幼鱼具备一定降血脂的功能，TG浓度无显著性变化可能与实验对象不同有关。鱼类GLU浓度在一定范围内升高表示鱼体消化吸收作用加强[38]。本研究中各处理组GLU浓度均有显著升高 (P<0.05)。血清ALT和AST是临床上普遍接受的分析肝脏健康的标志酶，而AKP在碱性条件下分解各种磷酸酯，其活性与细胞损伤有关[39-40]。本研究表明，适量的PEGG可以降低尖吻鲈血清中ALT和AST活性且不改变AKP活性，表明饲料中添加适量PEGG有利于肝脏健康，但过量添加又会导致ALT和AST活性升高，说明多糖的添加量并不是越高越好，这与谭连杰等[41]和汪成竹等[42]的研究结果相似。

综上，PEGG本身具备一定的促进消化能力，其抗氧化功能起到改善肠道的作用，此外PEGG还有一定护肝和降血脂功效。拌喂适量的PEGG能显著增强尖吻鲈幼鱼的消化能力和肠道抗氧化能力，并改善血清生化指标，提高尖吻鲈幼鱼生长性能。在本实验条件下，PEGG 的最适拌喂量为 20 g·kg−1。