三黄连散对罗非鱼人工感染无乳链球菌的保护作用

2021-08-27禹方晓王春会于美玲梁万文覃志彪胡庭俊

现代畜牧兽医 2021年8期

张文，禹方晓，王春会，于美玲，梁万文，李旻，覃志彪*，胡庭俊*

（1．广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005；2．广西壮族自治区水产科学研究院，广西南宁 530021）

罗非鱼链球菌病是渔业养殖生产中极为常见的疾病，其主要病原菌为化脓性链球菌、草绿链球菌、肺炎链球菌和无乳链球菌，而无乳链球菌是罗非鱼链球菌病重要的病原之一[1]。目前,防治该疾病的主要方法是化学消毒剂和抗生素类药物。但是，长期使用此类药物不仅会破坏养殖水域环境，而且会导致病原菌产生耐药性、鱼体药物残留超标，进而影响水产品的食用安全性[2-6]。据报道，大黄、黄檗、黄芩等中草药具有提高鱼类对营养物质的吸收、增强非特异性免疫力和抗应激的功能[7-9]。本试验选用广西大学动物科学技术学院自主研制的三黄连散[10-12]，在剂量筛选试验和靶动物安全性试验的基础上，进一步验证三黄连散在临床上预防无乳链球菌的作用，并观察比较三黄连散和市售三黄散对罗非鱼感染无乳链球菌的预防效果，为该制剂的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药品

三黄连散由广西大学动物科学技术学院研制，由山西首爱动物药业有限公司中试生产（产品批号：20170703，规格：每克含黄芩苷不少于80 mg）。

三黄散（水产用）由广西普大动物保健品有限公司生产（产品批号：兽药字200079213）。

1.1.2 试验饵料

试验饵料由百洋产业生产的罗非鱼膨化配合饲料403（产品标准编号：Q/BYS003-2019）。水产药物及饲料专用黏合剂，执行标准：GB 12309—90。

1.1.3 试验动物和菌株

重量为50~100 g的罗非鱼210尾，临床健康，未检出无乳链球菌等致病菌，购自广西水产研究所罗非鱼养殖基地，试验前进行场地适应性饲养7 d。

菌株为广西壮族自治区水产科学研究院鱼病防治研究室分离的无乳链球菌（编号：GX107）。无乳链球菌标准株为CMCC（B）32116（2015-12-02）。

1.1.4 培养基及主要试剂

血平板（环凯微生物科技有限公司，批号：J1424Y）、BHI（海博生物技术有限公司，批号：20180702）、革兰氏染色液试剂盒（海博生物技术有限公司，批号：20181108）、氯化钠（分析纯）。

设计的集成清扫装置配置包括:物料清除装置、物料回收机构(集料斗、给料机或其他卸料装置)、控制箱及管道等(见图1)。物料回收机构采用雾化抑尘系统，有效降低硫磺粉尘浓度。

1.1.5 仪器设备

试验中使用的主要仪器设备见表1。

表1 仪器设备Tab.1 Instruments and equipment

1.2 试验方法

1.2.1 含药饵料的制备

根据试验设计，取相应重量的中药制剂与等重量黏合剂混合，加适量水，搅拌使之成稀糊状后与饲料拌混均匀。阴干8 h，分装后密封保存于塑料袋，4℃保存备用。

1.2.2 无乳链球菌菌液制备

取出复壮后的菌种，迅速移入超净工作台，用无菌接种环挑取单个菌落接种于血平板上，于恒温箱37℃下培养16~18 h。用灭菌的棉签轻轻擦下菌落置于10 mL生理盐水中，离心（9 000 r/min、2 min），弃上清，用生理盐水反复吹打沉淀重悬至10 mL，重复2次后弃去培养基。根据麦氏比浊法调整菌液浓度至5.40×107CFU/mL，4℃保存备用。

1.2.3 试验设计

选取适应性饲养7 d后，相同规格的罗非鱼180尾，随机分为空白组、感染对照组、药物对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，共6组，每组30尾，分别饲养于400 L的塑料桶里。试验设计见表2。每天投喂饵料的量按照鱼体重的3%称取，分2次定时投喂，连续饲喂7 d。第8 d进行人工腹腔注射感染无乳链球菌，空白组腹腔注射灭菌生理盐水，其余各组腹腔注射无乳链球菌菌液，浓度为5.40×107CFU/mL，每尾罗非鱼注射量均为0.20 mL。试验期间，饲养的环境条件保持不变。

表2 试验分组及处理Tab.2 Grouping and treatment of tests

1.2.4.1 临床症状观察及致病菌分离鉴定

观察记录试验期间各组罗非鱼的临床症状表现，根据疗效评价标准表进行打分统计，计算每天平均分。死鱼取脑组织和肝、脾脏器接种于血平板培养，分离致病菌并鉴定是否为无乳链球菌。

1.2.4.2 疗效评价标准

通过全面系统搜集罗非鱼无乳链球菌病的临床症状，主要观察每组鱼的精神状态、眼球症状和食欲3种临床症状，每隔4~8 h监测每组鱼的情况并按照下述评分系统进行评分，并记录时间。临床症状评分标准见表3。

表3 临床症状评分标准Tab.3 Clinical symptom scoring criteria

1.2.5 死亡率和保护率

攻毒试验开始后，每天记录各组罗非鱼的死亡情况，并及时捞出死亡的罗非鱼。根据各组罗非鱼的死亡情况，计算攻毒后第7 d时，罗非鱼的死亡率，并计算三黄连散对罗非鱼的保护率。

1.2.6 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 18.0进行单因素方差分析，结果以“平均数±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 罗非鱼临床症状及疗效评价（见图1、图2）

给药7 d期间，各组罗非鱼采食正常，可按时按量完成采食，均未见任何不良反应，未发生病理变化和死亡等异常情况。

试验第8 d，除空白组外，对罗非鱼进行人工感染无乳链球菌。攻毒后第2 d，感染的罗非鱼表现为转圈或呈“假死”状、机体失去平衡不能正常游动或悬停、体色发黑、眼球浑浊、部分鱼眼球外凸、鳍条基部及腮盖多处充血等症状，与罗非鱼链球菌病典型症状相符。死鱼解剖可见肝、脾、胆均有不同程度的水肿，部分有腹腔内积水。灭菌环境下取肝脾组织划线接种于血平板，于37℃恒温培养20 h，经鉴定为无乳链球菌，确认死亡的罗非鱼为无乳链球菌感染。

由图1可知，空白组罗非鱼无不良症状，感染对照组罗非鱼精神萎靡、食欲废绝。饲喂三黄连散后，不同剂量组罗非鱼临床症状均明显改善，食欲逐渐恢复正常，表明饲喂不同剂量的三黄连散均可改善罗非鱼的临床症状且以高剂量组效果最好。

图1 罗非鱼临床症状计分曲线Fig.1 Clinical symptom score curve of tilapia

由图2可知，各三黄连散组罗非鱼与感染对照组相比死亡率均显著减低，且高剂量组效果最显著。

图2 罗非鱼累计死亡数Fig.2 Cumulative death of tilapia

2.2 三黄连散对感染无乳链球菌罗非鱼死亡率和保护率的影响（见表4）

由表4可知，空白组死亡0尾，死亡率为0；感染对照组死亡18尾，死亡率达60%；药物对照组死亡8尾，与中剂量组死亡数一致。经过分析，除低剂量组以外，各剂量组死亡数均显著低于感染对照组（P＜0.01）；对照药物组死亡数与高、中剂量组差异不显著（P＞0.05）；高剂量组死亡数只有4尾，与空白组相比差异不显著（P＞0.05）。高剂量组的预防效果最佳。

表4 三黄连散对感染无乳链球菌罗非鱼死亡率和保护率的影响Tab.4 Effect of Sanhuanglian powder on the mortality and protection rate of tilapia infected with Streptococcus agalactiae

3 讨论

罗非鱼是我国重要的水产养殖品种。但是，近年来随着养殖密度的不断增大，养殖水域环境的不断恶化，造成养殖生物大规模死亡[13]。无乳链球菌是易感染人类、家畜和水生动物的条件性致病菌，其产生的多种内毒素及表面蛋白对无乳链球菌的致病性起促进作用[14]。在该病的初期使用抗生素取得了良好的治疗效果，但随着大规模的投入应用，病菌的抗药性逐步提高，防控难度变大，防控成本变高，并且菌株的活力和传染性更强[15]。

近年来，复方中草药制剂在防治水产动物细菌性疾病已取得良好的效果。彭金菊等[16]研究发现，五倍子与其他中草药组成的复方制剂在水产动物细菌性疾病方面有较好的防治效果。高瑞松等[17]研究发现，中药虎杖、大黄素等成分具有改善NOD小鼠微生物炎症模型组织状态的作用。牟绍霞[18]研究发现，在饲料中添加黄连须和小檗碱可预防草鱼传染性疾病。然而，关于中草药防治罗非鱼无乳链球菌病的研究多为单味中草药的体外抑菌试验。华亚南等[19]研究发现，黄连、五倍子和公丁香等对无乳链球菌有较强的抑菌活性；黄连、大黄、黄檗和连翘等对海豚链球菌有较强的抑菌活性。吴梦晓等[20]研究发现，绞股蓝、黄檗、冬凌草和贯众的醇提取液对无乳链球菌有显著抑菌活性。陈燕晴等[21]研究表明，三黄连散对罗非鱼无乳链球菌体外抑菌效果较好。

本试验研究药物为广西大学动物科学技术学院研制的针对罗非鱼无乳链球菌病的三黄连散复方中草药制剂。试验结果表明，三黄连散的高、中剂量组和对照药物组的罗非鱼死亡率均显著低于感染对照组，高剂量组保护率达77.77%，中剂量组和药物对照组保护率一致，为55.55%，表明三黄连散对预防罗非鱼感染无乳链球菌病效果显著。陆晶莹等[22]研究发现，三黄连合剂可有效预防罗非鱼感染无乳链球菌病，其中高剂量组保护率为47.82%，与本研究结果类似。李庆勇等[23]研究发现，在罗非鱼养殖桶中种植一定数量的鱼腥草，饲养30 d，可有效提高罗非鱼的非特异性免疫，提高人工感染无乳链球菌的存活率，其保护率为57.53%。从临床症状计分曲线分析，高剂量组、中剂量组和药物对照组均可明显减轻罗非鱼感染无乳链球菌的症状。从累计死亡数分析，三黄连散中剂量组预防效果与药物对照组效果类似；在临床症状打分曲线中几乎一致，但三黄连散中剂量组累计死亡数上升更为缓慢。