微型氢化物发生-原子荧光法测定水产品汞形态

程雪萌，罗明标*，席群丽，左丽华，李咸宇，王为民，杨梅，龚治湘

（1.东华理工大学江西省合成化学重点实验室，江西 南昌 330013；2.谱焰实业（上海）有限公司，上海 200000）

汞是影响人类和生态系统健康的环境污染物之一[1]，所有汞都是有毒的，汞的毒性、生物利用度和流动性不仅取决于其总浓度，而且还取决于其化学形式[2]，形态不同，产生的毒性也不同，其中有机汞化合物通常比无机汞更具毒性[3]。虾蟹等水产品处于水生食物链较高位置，经食物链累积和生物放大作用，其体内通常积累了高浓度的有机汞，并通过食物链富集到人体内，对人体产生毒害作用[4-5]。因此，水产品中的形态分析具有非常重要的社会意义。汞形态分析最常见的方法是将一种强大的分离技术与一种灵敏的原子光谱检测仪联用，例如气相色谱（gas chromatography，GC）、液相色谱（liquid chromatography，LC），或者是毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）与电感耦合等离子体发射光谱（inductively coupled atomic emission spectroscopy，ICP-AES）、电感耦合等离子质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）、原子荧光光谱（atomic fluorescence spectroscopy，AFS）、原子吸收光谱（atomic absorption spectroscopy，AAS）等联用[6-13]，尽管这些联用技术强大，可以提供更多的信息，但是也存在一些缺点，大多仪器造价昂贵不适于普及，且均需要分离富集等复杂的预处理步骤[14-17]。而本试验不需联用技术，单用成本低廉、灵敏度高，基体干扰小的原子荧光光度计[18-19]即可实现汞形态的准确检测。试验利用汞不同形态的化学行为，以溴化剂作为有机汞的消解剂，以非色谱方法将有机汞转化为无机汞，在有无溴化剂的条件下，检测水产品中总汞和无机汞，利用差减法即可得出有机汞的含量。采用具有新型微型氢化物发生装置的原子荧光光度计[20]，将氢化物发生控制在一个非常狭小的空间里，使氢化物可以在最短的时间和路径内被快速送入原子化器，可以有效地降低汞的记忆效应，使得原子荧光光度计在检测有机汞的同时提高检测的准确性。本文以溴化剂作为有机汞消解剂，微型氢化物发生-原子荧光光谱法作为检测方法，实现对水产品中汞形态准确检测，该方法高效、简便、价格低廉，为水产品中汞形态的测定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸（优级纯）、硝酸（优级纯）、溴酸钾（分析纯）、盐酸羟胺（分析纯）、硼氢化钠（分析纯）、高锰酸钾（分析纯）、过硫酸钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：西陇化工股份有限公司；溴化钾（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；Hg标准储备液（10 μg/L）、氯化甲基汞、氯化乙基汞标准溶液：Merck公司；水产品：市售。

1.2 仪器与设备

CAF-1800原子荧光光度计：谱焰实业（上海）有限公司；TG18-WS台式高速离心机：长沙市维尔康湘鹰离心机有限公司；摩尔分析型超纯水器制备：上海摩勒生物科技有限公司；0.45 μm滤膜：美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

称取样品 0.50 g～2.0 g（精确至 0.000 1 g），置于15 mL塑料离心管中，加入10 mL的盐酸溶液（5 mol/L），25℃下超声30 min并放置过夜。25℃超声水浴提取60 min，期间振摇数次。4℃下以8 000 r/min转速离心5 min。随后吸取上清液，并用0.45 μm滤膜过滤，保存于4℃。

1.3.2 样品中有机汞及无机汞的测定

取2.5 mL溶液置于离心管中，加入5 mL 50% HCl，定容至25 mL后，直接上机检测，结果为无机汞含量。取2.5 mL溶液置于离心管中，加入5 mL 50% HCl，0.5 mL溴化剂（30 g/L溴化钾+10 g/L溴酸钾），塞上瓶盖，放40 min，后滴加1滴～3滴盐酸羟胺溶液（30 g/L），用力振摇100次，至溶液由黄色转为无色，定容至25 mL，上机检测总汞含量。有机汞的含量为两者之差。同时做空白试验。

1.3.3 有机汞对无机汞测定的影响

从 50 ng/mL Hg 标准溶液里分别取 0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于 25 mL 容量瓶中，各加入5 mL 50% HCl，用水稀释至刻度摇匀备用，配制成系列浓度为 0、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ng/mL 的无机汞溶液。从25 ng/mL氯化甲基汞和氯化乙基汞混标溶液（其中氯化甲基汞溶液与氯化乙基汞溶液浓度相同）里分别取 0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于25 mL容量瓶中，各加入5 mL 50% HCl，用水稀释至刻度摇匀备用，配制成系列浓度为 0、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ng/mL 的有机汞溶液。

1.3.4 溴化剂用量及消解时间方法建立

两组样品，第一组分别取样品组织液2.5 mL置于若干个离心管中，加入5 mL 50% HCl，2.5 mL 10 ng/mL的氯化甲基汞乙基汞混标溶液，再分别加入0.3、0.5、1、2、3 mL溴化剂，塞上瓶盖，在25℃下分别放置20、40、60、80、100、120 min，后滴加 1 滴～3 滴盐酸羟胺溶液，用力振摇100次，至溶液由黄色转为无色，定容至25 mL。第二组不加氯化甲基汞乙基汞混标溶液，其它条件同上，上机检测并计算回收率。

1.3.5 标准溶液的配制

汞标准工作液：用10 μg/L Hg标准溶液（含5% HNO3）稀释至 100 ng/mL（含 5% HNO3），临用时将此溶液稀释成5 ng/mL标准溶液（含2% HNO3）。分别取此溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于 25 mL 容量瓶中，各加入5 mL 50% HCl，用水稀释至刻度摇匀备用，配制成系列浓度为 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ng/mL 的 Hg溶液。

1.3.6 参数优化

配制0.5 ng/mL的Hg标准溶液，固定其它条件不变，分别改变NaBH4溶液在0.02%～0.50%之间，优化出最佳NaBH4浓度；固定其它条件不变，分别改变盐酸溶液浓度在5%～20%之间，优化出最佳盐酸浓度；固定其它条件不变，分别改变灯电流在5 mA～35 mA之间，优化出最佳灯电流；固定其它条件不变，分别改变负高压在200 V～250 V之间，优化出最佳负高压。

1.3.7 CAF-1800原子荧光光度计仪器工作条件

光电倍增管负高压：220 V；灯电流：15 mA；原子化器高度：9 mm；载带气流量：500 mL/min；屏蔽气流量：1 000 mL/min；延迟时间：0 s；读数时间：10 s；进样量：2 mL；测量方法：标准曲线法；读数方式：峰面积。

1.4 数据处理

样品分析均重复3次，结果以平均值±标准差的形式表示。采用数学图形分析软件Origin85绘图，用Excel软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 有机汞对无机汞测定的影响

分别配制无机汞系列和有机汞系列，在不加溴化剂的情况下，上机测定无机汞和有机汞的荧光强度。有机汞对无机汞测定的影响见图1。

图1 有机汞对无机汞测定的影响Fig.1 The influence of reducing agent on the determination of organic mercury

图1表明，无机汞能与NaBH4反应且呈现良好的线性关系，而有机汞只能与部分NaBH4反应[21]，5 ng/mL的有机汞产生的信号小于同浓度无机汞信号的3%。因此在实际样品分析中，有机汞的存在不会影响到无机汞的测定，直接测出的是无机汞。将样品氧化后，有机汞可以转化成可测定的无机汞，实现无机汞和有机汞的测定。

2.2 有机汞氧化剂的选择

将有机汞转化为无机汞，常用的氧化剂有高锰酸钾、过硫酸钠、溴化剂等[22]。利用高锰酸钾溶液（2%）、过硫酸钠（2%）、溴化剂等氧化剂对1 ng/mL烷基汞标液进行氧化。表1为不同氧化剂及不同条件下对标液中有机汞的氧化结果。

表1 25℃下不同氧化剂的消解效果（n=6）Table 1 Digestion effect of different oxidants at room temperature（n=6）

由表1可知，过硫酸钠在25℃下不能很好地将有机汞转化成无机汞，通常通过加热、微波或紫外线辅助处理，以提高有机汞的转化率[23]。高锰酸钾在25℃下可以很好地转化有机汞，但其作为氧化剂时，容易在管路内壁生成二氧化锰，既会造成管路堵塞又会对元素产生吸附[5]。溴化剂在25℃下就可以很好地将有机汞转化成无机汞，且不会出现管路堵塞的情况。综合考虑，选择溴化剂作为氧化剂。

2.3 溴化剂用量及消解时间的选择

有机汞是否能够消解完全，溴化剂的用量以及消解时间是关键因素。取若干份相同的螃蟹组织样品提取液，改变溴化剂的用量和消解时间对其进行氧化，结果见图2。

图2 溴化剂在不同用量和消解时间下对有机汞氧化结果的影响Fig.2 The effect of brominating agent on the results of organic mercury oxidation under different dosages and digestion times

由图2可知，当溴化剂含量在0.5 mL，消解时间达到40 min时回收率最好，因此最终选择溴化剂用量为0.5 mL，消解时间为40 min。

2.4 无机汞和有机汞的标准曲线

为了验证溴化剂消解后的有机汞和无机汞溶液能否用同一条标准曲线进行测定，配制了加入相同溴化剂用量的有机汞标液、无机汞标液、有机汞与无机汞混标溶液等3个系列标准溶液,结果见图3。

图3 3种系列溶液标准曲线Fig.3 Standard working curves of three series of solutions

由图3可知，3种标液的标准曲线的斜率很接近，线性关系良好，表明总汞和无机汞可以用同一条曲线进行测定，同时也可以进一步证明，溴化剂可以将有机汞完全氧化成无机汞。

2.5 参数优化

2.5.1 还原剂溶液浓度的优化

硼氢化钠的浓度会影响到Hg的荧光强度，浓度太低会导致汞的荧光信号变弱，浓度太高时反应产生的氢气过多会稀释汞蒸气，使得灵敏度下降，精度变差。因此探究了不同NaBH4浓度下Hg的荧光强度，结果见图4。

图4 不同NaBH4浓度下Hg的荧光强度Fig.4 Fluorescence intensity of Hg under different NaBH4 concentrations

通过试验结果综合判断，NaBH4溶液的浓度在0.2%时作为还原剂的效果最好。

2.5.2 盐酸溶液浓度的优化

盐酸的浓度会影响氢气的生成，进而会使荧光强度受到影响。在优选盐酸溶液浓度的过程中，不同盐酸浓度对Hg荧光强度的影响见图5。

图5 不同盐酸浓度下Hg的荧光强度Fig.5 Fluorescence intensity of Hg under different HCl concentration

通过试验结果综合判断，盐酸溶液的浓度在10%时的效果最好。

2.5.3 灯电流的优化

增加灯电流，会使汞的荧光强度增加，并且可以改善低浓度处的线性。但是灯电流过大会产生自吸现象，缩短高强度汞空心阴极灯的寿命。在优选灯电流的过程中，不同灯电流对Hg荧光强度的影响见图6。

图6 灯电流对汞荧光强度的影响Fig.6 Effect of lamp current on mercury fluorescence intensity

由图6可以发现，汞的荧光强度随着灯电流的增大而不断增大，但是较大的灯电流会减少高强度空心阴极灯的寿命，因此，通过试验结果综合判断，灯电流在15 mA时已经可以满足正常测定需求。

2.5.4 负高压的优化

负高压增加，会使噪声加大，同时信号也会增加。在优选负高压的过程中，不同负高压对Hg荧光强度的影响见图7。

图7 负高压对汞荧光强度的影响Fig.7 Influence of negative high pressure on mercury fluorescence intensity

通过试验结果综合判断，负高压在220 V时已经可以满足正常测定需求。

2.6 精密度与检出限

配制质量浓度为 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ng/mL 的无机汞标液，按照试验方法在仪器最佳条件下考察其线性范围，在0～1 ng/mL范围内，无机汞标液回归方程为y=2416.9x+5.3，相关系数r=0.999 7。按照试验方法测得本法的检出限为（n=11）0.014 0 ng/mL，对螃蟹组织样品连续测定7次，求得相对标准偏差为4.2%。

2.7 回收率

加标回收测定结果见表2。

表2 加标回收测定结果（n=6）Table 2 Test results of spiked recovery（n=6）

在螃蟹体肉组织和花甲体肉组织的提取液中加入不同量的有机汞标准溶液，放置大约30 min，随后按照样品分析步骤进行分析测定。得到了各样品的加标回收率在86%～101%之间，相对标准偏差在1.5%～6.2%之间。

2.8 样品分析

采用建立的方法随机对市售不同水产品的各个部位的无机汞和总汞进行检测，结果见表3。

表3 螃蟹中有机汞和无机汞的含量结果（n=3）Table 3 Results of the content of organic and inorganic mercury in crabs（n=3）

通过对实际样品的分析，发现在螃蟹样品中汞主要以有机汞形式存在，其中蟹足肉、螃蟹体肉、花甲肉、虾肉的有机汞含量相对较高，所有水产品中各个部位的含量均未超过GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》中水产生物及其制品中甲基汞的限量（0.5 mg/kg）。

3 结论

本文对微型氢化物发生-原子荧光光谱法检测水产品中汞形态的几个影响因素进行了优化和讨论，并在最优的条件下对虾、蟹、花甲等各个部位进行了测定，验证了该方法的有效性。试验结果表明，以溴化剂作为氧化剂，建立的微型氢化物发生-原子荧光光谱法测定水产品中有机汞的方法是准确可行的。它具有简单、无色谱、低成本和高灵敏度的特点。基于不同汞形态不同化学的非色谱方法为汞形态分析开辟了另一条途径。适用于水产品中有机汞的准确测定。