泪腺良性淋巴上皮病变基因网络分析及关键枢纽基因鉴定

张黎黎，刘文辉，刘小静，丁 岩，张 琪，刘 瑜，刘林嶓

(1.郑州大学第一附属医院整形外科，河南 郑州 450052；2.郑州大学第一附属医院眼科，河南 郑州 450052)

泪腺良性淋巴上皮病变(benign lymphoepithelial lesion，BLEL)是一种常表现为泪腺无痛性肿大的良性疾病，治疗方法以激素为主，还包括放疗、手术等[1]。但激素作用的个体差异明显，有些患者接受激素治疗的疗效并不理想。因此，进一步明确BLEL的发病机制是十分必要的。本研究基于BLEL基因芯片数据，构建了基因共表达网络，并鉴定其中的关键致枢纽病基因，有助于在分子水平上系统全面明确BLEL的发病机制，对BLEL的治疗也有一定的启示作用。

1 资料与方法

1.1 数据获取本研究选取了Gene Expression Omnibus(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库中编号为GSE76497的数据集，该数据集中包括18例BLEL和作为对照的18例眼眶海绵状血管瘤。该数据集也曾被Adzavon等[2]和Li等[3]用于研究BLEL的发病机制，但其研究方法与本研究并不相同。

1.2 差异基因及聚类分析为避免与BLEL发病关联较弱基因的干扰，本研究利用双尾Studentt检验求得了2组的差异表达基因，取检验水准α=0.05。在获得差异基因后，使用Mev软件[4]对2组进行聚类分析，排除异常样本的数据。

1.3 共表达网络构建基因共表达网络是基于加权基因共表达网络分析的方法构建的。WGCNA的方法在Web of Science数据库中被引已经超过5 000次[5]，其有效性得到了广泛的认可。不同于常规的分析方法，加权基因共表达网络分析将基因表达信息拟合为无尺度网络，再根据网络的拓扑学特性，将基因网络分为若干基因模块，并从中选择与表型相关性最高的关键枢纽基因模块，进一步明确模块中的关键枢纽基因[6]。构建的基因共表达网络通过Gephi软件进行可视化[7]。

1.4 基因模块功能注释利用ClueGo[8]对关键枢纽基因模块进行基因本体论(gene ontology,GO)[9-10]和通路分析的注释，以明确关键枢纽基因模块的具体功能。GO和通路分析时，上调基因和下调基因分开进行分析。

2 结果

2.1 差异基因及聚类分析共有14 878个基因在2组中差异表达，经过Mev的聚类分析，差异基因能够较好将2组样本区分开来。其中编号为GSM2027016和GSM2027017的2个样本与其他样本差异较为显著，提示样本可能存在异常。为保证下游分析的准确性，这2个样本并未纳入下游分析。

2.2 基因共表达网络在上述差异表达基因的基础上，本研究进一步构建了BLEL中基因共表达网络，因网络中基因较多，每个基因模块内仅取排名最靠前的30个关键枢纽基因，构建基因共表达网络的骨干。BLEL的基因共表达网络共分为了12个基因模块，每一个基因模块由一种颜色命名，不能归类到任何基因模块的基因均归类到grey模块。本研究进一步明确每个基因模块与BLEL的相关性发现，与BLEL相关性最高的是名为turquoise的基因模块，相关系数为-0.94，对应的P<0.001。进一步对turquoise模块内的基因进行排序发现，排名靠前的关键枢纽基因分别是MAP1B、DOCK6、RGS5、ESAM和PDE5A。

2.3 基因模块功能注释对turquoise模块中的基因进行功能注释的过程中，上调基因和下调基因分开进行了分析。Turquoise模块中上调基因仅137个，而下调基因有5 516个，因上调基因数目过少，并未得到达到统计学要求的结果，因此该部分仅报告下调基因的结果。GO分析的结果分析发现，P值最小的10个条目均属于基因本体论中Biological Process的类别，且主要与脉管系统的发育相关。通路分析结果显示，这些通路主要与细胞连接和心血管系统相关。

3 讨论

本研究构建了BLEL中的加权基因共表达网络，明确了其中与BLEL相关性最高的基因模块及其关键枢纽基因，有助于加深我们对BLEL发病机制的理解，这些关键枢纽基因也有可能作为治疗BLEL的新的靶点。

本研究首先明确了14 878个差异基因，这个数目比同类研究多。一般而言，类似研究会进行多重检验校正[11]，目的是减少假阳性，代价是一部分差异表达的基因会被过滤掉。为了让尽可能多的差异基因保留下来，本研究没有进行多重检验校正这一步骤。在类似研究中也常常会根据P值和差异表达倍数进行双重过滤，以挑选出差异表达显著的基因。但生物反应多是级联放大的瀑布式反应，推动生理病理过程发展的上游基因往往差异表达倍数较下游基因小，而这些上游基因的作用可能比下游基因更重要[12]。因此，本研究也没有进行P值和差异表达倍数的过滤。

在构建的加权基因共表达网络中，turquoise模块与BLEL的相关系数为-0.94，对应的P<0.001，可以看出两者的相关性十分显著。进一步的GO分析发现，与脉管系统发育相关的GO条目排名最高。通路分析结果表明，细胞连接和血管平滑肌等通路被激活。这些结果与BLEL的组织学特点有一定的相关性，佐证了turquoise模块与BLEL的相关性。

Turquoise模块中排名靠前的关键枢纽基因依次是MAP1B、DOCK6、RGS5、ESAM和PDE5A。进一步的文献检索发现，这些关键枢纽基因与BLEL的发病均具有较强的相关性。如很多研究证实IgG4与BLEL发病具有较强的相关性[13]，而MAP1B与IgG蛋白表达具有一定的相关性[14-15]。BLEL是一种自身免疫疾病，而MAP1B[16]、RGS5[17-18]、ESAM[19]和PDE5A[20]均与自身免疫疾病有较强的相关性。BLEL的组织中有大量淋巴细胞浸润，而MAP1B[21]、ESAM[22]和PDE5A[23]对淋巴细胞功能均具有重要的调节作用。这些关键枢纽基因与BLEL关系密切，可以作为BLEL治疗的潜在靶点。

BLEL组织中有大量淋巴细胞浸润，并且可能与淋巴瘤、白血病等并发[24]，提示其与血液系统恶性肿瘤的相关性[25-26]。如MAP1B[27]、RGS5[28]和ESAM[29]均与淋巴瘤的发生、发展有一定的相关性。而ESAM[30]、DOCK6[31]和PDE5A[32]与白血病具有一定的相关性。这些关键枢纽基因与血液系统的相关性在一定程度上可以部分解释，BLEL与血液系统恶性肿瘤的伴发现象，对血液系统肿瘤药物的开发[33]也有一定的提示作用。

综上所述，本研究构建了BLEL中的加权基因共表达网络，加深了我们对BLEL发病机制的理解，这些关键枢纽基因也可作为治疗BLEL的新靶点，对血液系统相关肿瘤性疾病治疗也有一定的启示。