百草枯所致肺损伤大鼠肺组织凋亡情况及凋亡相关基因表达情况▲

武梓萌 罗毅沣 张剑锋

(广西医科大学第二附属医院急诊科，南宁市 530007，电子邮箱：18245280117@126.com)

研究表明，百草枯可促进炎症反应的发生，诱导细胞凋亡[1]。百草枯进入机体后会迅速分布在许多重要器官中，其中肺脏是主要靶器官之一，中毒患者早期即可出现急性肺损伤(acute lung injury，ALI)[2]，其主要病理机制可能是肺组织炎症和(或)细胞凋亡[3]，但具体分子机制尚未阐明。本研究拟建立百草枯中毒肺损伤大鼠模型，检测其损伤肺组织细胞凋亡情况，另采用PCR芯片检测凋亡基因，以了解百草枯中毒导致大鼠肺损伤的可能机制，为临床防治提供思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康且无特定病原体级SD雌性大鼠18只，购自广西医科大学实验动物中心(许可证号：SCXK桂2020-0003)。鼠龄6～8周，体质量为(200±20)g，洁净空调房间内喂养，实验室温度为(23±3)℃，湿度为(55.5±10.0)%。大鼠分笼饲养(6只/笼)，给予颗粒饲料喂养，自由饮水。

1.2 实验主要药品及试剂 二氯百草枯(Sigma-Aldrich公司，批号： 856177-1G)，TUNEL试剂盒(罗氏公司，批号：11684817910)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液(博士德生物工程有限公司，批号：AR1177)，总RNA 提取试剂RNAiso Plus(TaKaRa公司，批号：9109)，反转录试剂PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa公司，批号：RR036A)，TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司，批号：RR820A)，2×RealStar Green Fast Mixture(with ROX Ⅱ)(GenStar公司，批号：A304-10)。

1.3 建模及分组 将18只SD大鼠按随机数字表法分为百草枯组和阴性对照组，各9只。百草枯组SD大鼠给予单剂量的二氯百草枯(20 mg/kg )腹腔注射；阴性对照组SD大鼠给予和百草枯组等量的生理盐水腹腔注射。在腹腔注射后24 h，用10%水合氯醛(0.03 mL/kg)进行腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于大鼠固定板上，剪开胸腔，暴露心肺及大血管，结扎大血管后使用0.9%氯化钠冲洗肺血管中残留的血液。取右上肺用RNA保存液置于-20℃冰箱保存，备用于PCR检测；取左肺叶置于10%中性甲醛中固定24 h，用于TUNEL染色凋亡检测。

1.4 凋亡实验 将甲醛固定24 h后的肺组织常规脱水、透明、 包埋、 切片、脱蜡后,用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤3次，每次5 min，加脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP 缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)检测液100 μL ，37℃避光孵育60 min，再用PBS洗涤3次，每次5 min，滴加DAPI染色液100 μL，室温避光孵育20 min，再用PBS洗涤3次，每次5 min，水溶性封片剂封片后荧光显微镜下观察，可看到凋亡细胞核为绿色荧光，DAPI染色细胞核为蓝色荧光。根据以下公式进行凋亡率的计算:凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%,每个样本随机计数5个视野(400倍视野),取均值。

1.5 大鼠细胞凋亡PCR芯片检测和实时定量PCR验证 取右肺组织进行研磨，裂解提取RNA，配置RT反应液，最终体积为10 μL(5×PrimeScriptTMRT Master Mix 2 μL，Total RNA 2 μL，RNase Free dH2O 6 μL)，轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:37℃15 min(反转录反应)； 85℃ 5 s(反转录酶的失活反应)；4℃(保存)。配置定量PCR反应液，最终体积为20 μL，包括TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 2×5 μL，上游引物 0.4 μL，下游引物 0.4 μL，ROX Reference Dye 50× 0.2 μL，DNA Sample 1 μL，ddH2O 13 μL。轻柔混匀后进行定量PCR反应，条件如下：95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，循环40次。使用大鼠细胞凋亡定量PCR阵列分析基因表达谱(芯片购自上海启因生物科技有限公司)，具体芯片目的基因信息见表1。用Wcgene Biotech软件进行数据分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为内源对照，基于循环阈值(Ct值)，采用2-ΔCt的方法计算相对表达倍数(fold值)[4]，并且认为相对表达倍数比(fold值百草枯组/ fold值阴性对照组)<0.5或>2，且P<0.05的值是有意义的[5]，再将数据标准化为log2值。同时对目的基因进行生物信息分析进一步筛选差异表达基因。然后通过ABI7500 qRT-PCR系统(Thermo Scientific公司)对所筛选的3个基因(引物序列见表2)表达水平进行定量分析。配置实时定量PCR反应液，最终体积为20 μL，包括2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，RNase Free dH2O 6 μL，DNA Sample 2 μL；设置程序如下：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循环40次。使用2-△△Ct的方法计算选定基因的相对表达水平(fold change，FC)，再将数据标准化为log2值，利用选定基因的标准化相对表达水平(Log2FC)对定量PCR阵列分析基因表达谱结果进行验证。

表1 目的基因及相对表达倍数比

表2 引物名称及引物序列

1.6 生物信息学分析 使用R软件(x64 3.5.1)和RStudio软件，取凋亡PCR芯片中目的基因，利用两组数据的fold值均值制作热图，用-lgP值和log2(fold值百草枯组/ fold值阴性对照组)绘制火山图，以log2(fold值百草枯组/ fold值阴性对照组)<-1或>1，且-lgP值>1.3为标准，筛选差异表达显著的基因。利用STRING软件 (http://string.embl.de/cgi/input.pl?User Id=vb IZut BFUXxs&session Id=u98tg B1k Bto L&input_page_show_search=on)和Cytoscape软件，分析目的基因所编码蛋白的蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)关系。

1.7 统计学分析 使用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验或t′检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组肺组织TUNEL染色结果 百草枯组大鼠肺组织中TUNEL阳性细胞比例为 (11.84±0.80) %,高于阴性对照组的(1.07±0.14) %(t=39.783,P<0.001)，见图1。

图1 两组TUNEL染色情况 (×400)

2.2 大鼠凋亡PCR芯片检测结果和生物信息学分析结果 凋亡PCR芯片共筛选出3个差异表达基因，百草枯中毒大鼠肺组织的TNFSF10、FASLG和TNFRSF1B基因表达降低。凋亡PCR芯片中目的基因热图见图2，通过火山图(图3)筛选出TNFSF10、TNFRSF1B、FASLG为差异表达显著的基因。PPI网络显示了TNFSF10、TNFRSF1B、FASLG和其他凋亡基因的交互关系，并利用Cytoscape软件识别最显著模块，见图4。

图2 凋亡PCR芯片目的基因热图

图3 火山图

图4 目的基因所编码的PPI网络

2.3 实时定量PCR验证结果 使用实时定量PCR验证TNFSF10、TNFRSF1B、FASLG的表达情况，结果也显示,百草枯组的TNFSF10、TNFRSF1B、FASLG的表达水平均低于阴性对照组(均P<0.05)，见表3。

表3 3个基因的实时定量PCR验证结果

3 讨 论

坏死性凋亡是细胞程序性死亡的一种类型，与其他细胞程序性死亡相比，坏死性凋亡具有独特的细胞形态变化和生化特征[6]。死亡受体配体、干扰素和病毒感染等各种刺激均可引发坏死性凋亡。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)属于死亡受体配体家族，可以与膜上的受体结合，诱导细胞凋亡[7]。已有研究表明，百草枯刺激TNF和白细胞介素6等因子与活性氧形成正反馈回路，使中毒组织持续损伤凋亡[8]。本研究通过TUNEL实验证实了百草枯组大鼠的肺组织存在凋亡，通过大鼠细胞凋亡PCR芯片进行测序，并对测序数据进行生物信息学分析，筛选出3个有意义的差异表达基因，即TNFSF10、FASLG、TNFRSF1B，再对这3个基因进行实时定量PCR验证，结果证实PCR芯片与实验数据有一致的趋势。

TNFSF10又名肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，属于TNF超家族。TNFSF10在免疫系统的多种细胞如自然杀伤细胞、T淋巴细胞、自然杀伤T淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞中表达，并且在病原抵抗、免疫调节、肿瘤监视等多个领域都起着重要的作用。TNFSF10通过激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-3和Caspase-8，诱导受感染细胞短时间内发生凋亡，有效地防御病原体的扩散[9]，因此能有效地增强生物自身的免疫力，但在正常健康细胞中未检测到其促凋亡活性[7]。在本研究中，百草枯组肺组织中的TNFSF10表达相对阴性对照组下调，可能是人体自我调节对抗百草枯诱导的细胞损害，其下调可抑制Caspase-3和Caspase-8等相关凋亡因子表达，从而抑制细胞发生凋亡。

FASLG及其受体(FAS)属于TNF家族。FAS是TNF受体超家族的原型成员，介导人体内的Caspase家族尤其是Caspase-8前体和Caspase-10前体的募集；募集后进入死亡诱导信号复合物以其活性形式被加工并激活，触发由其他前胱天蛋白酶组成的生化级联反应，最终导致细胞凋亡[10]。但也有部分研究表明，在多种癌症中均出现FASLG下调，从而调节肿瘤细胞的凋亡和增殖[11-13]。有研究表明活性氧刺激上皮细胞后，FASLG的含量及FAS的mRNA和蛋白质水平明显降低，并出现上皮细胞凋亡[14]。而百草枯可以显著刺激活性氧的增加，故在本研究中，可能是因百草枯刺激活性氧的表达上调，导致FASLG的表达降低。

TNFRSF1B是TNF受体超家族的成员[15]，可以激活经典的激活转录因子核因子κB和c-Jun N端激酶信号传导[16]，导致抗凋亡和促炎反应的产生；其下调意味着抗凋亡减弱，可能间接促进了百草枯组大鼠肺组织细胞凋亡的发生[17]。

综上所述，在百草枯中毒导致的大鼠肺组织凋亡的模型中，TNFSF10、TNFRSF1B、FASLG的表达下调，三者可能在大鼠肺组织凋亡中发挥重要作用，但其明确的下调机制仍不明确，有待进一步的实验研究。