SAMHD1在胃癌中的表达情况及其与预后的相关性

王 健 李雪薇 徐 钧

(山西医科大学第二医院普外科，太原市 030001，电子邮箱：425505180@qq.com)

胃癌是起源于胃黏膜上皮组织的一种恶性肿瘤，发病率位居全球第二，全国第一[1]。寻找相关的肿瘤标志物对于制定胃癌个体化治疗方案[2-4]、预后评估、术后复查等均有重大的临床意义。不育α基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domain-containing protein 1，SAMHD1)是一种广泛存在于髓核细胞中的抗病毒蛋白[5]，其可参与病毒复制的逆转录过程，调控脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP)的水解进程，进而调控DNA复制，发挥抗病毒的作用[6]。近年来有研究显示，SAMHD1在结直肠癌[7]、肺癌[8]、肝癌[9]、慢性淋巴细胞白血病[10]中存在基因突变现象，可导致SAMHD1表达明显下调，是一种潜在抑癌基因，其内在机制可能与肿瘤细胞的基因突变、表观遗传学的改变有关。但目前尚未有关于SAMHD1在胃癌中作用的研究，而作为广谱抗病毒和抗肿瘤蛋白，其可能在胃癌中也存在突变现象。本研究探讨SAMHD1在胃癌组织中的表达及其与预后的相关性，为寻找胃癌患者的肿瘤标志物、治疗靶点和判断预后提供新方向。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2011年1月至2018年7月在山西省肿瘤医院进行手术治疗，术后病理明确诊断为胃癌的320例患者的手术标本。纳入标准：初诊即确诊为胃癌的患者。排除标准：(1)术前接受过新辅助放化疗治疗的患者；(2)合并远处脏器转移的患者。其中男性260例，女性60例；年龄≤60岁196例，>60岁124例；肿瘤部位：胃窦部100例，贲门部155例，胃体部65例；病理分期参照2016年10月国际抗癌联盟和美国肿瘤联合会颁布的第八版胃癌原发肿瘤-区域淋巴结-远处转移(tumor-node-metastasis，TNM)分期系统[11]：Ⅰ期47例，Ⅱ期79例，Ⅲ期182例，Ⅳ期12例。本研究通过山西省肿瘤医院医学伦理委员会审批，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 SAMHD1多克隆抗体(生产批号：GR163628-2)购自杭州以恒生物科技有限公司，二抗酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物、磷酸缓冲盐溶液、二氨基联苯胺显色剂、免疫组化抗原修复缓冲液(统一生产编号：G24958)购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。

1.3 免疫组化试验方法 将胃癌组织经甲醛固定后，石蜡包埋，切片，厚度约4 μm。对组织切片进行常规脱蜡、水化，采用过氧化氢去离子水孵育，阻断内源性过氧化物酶的干扰。将脱蜡后的石蜡切片置于切片架上，加入免疫组化抗原修复缓冲液(高pH，50×)，确保组织完全浸没在溶液中，然后采用高压法进行抗原修复，加热10 min后自然冷却20 min，确保抗原充分修复。随后用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，3 min/次。取出切片，将3%过氧化氢与组织避光孵育15 min后，用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，3 min/次。然后滴加50 μL 兔抗SAMHD1多克隆抗体工作液于组织上，4℃冰箱孵育过夜。一抗孵育完毕，用磷酸缓冲盐溶液冲洗切片3次，3 min/次。再滴加50 μL二抗于组织上，室温孵育20 min；孵育完毕，将切片置入磷酸缓冲盐溶液中冲洗3次，3 min/次，取出切片。同时配置DAB工作液，按每毫升显色缓冲液(B液)中加入DAB显色剂(A液)约40 mL的比例配置免疫显色试剂，混匀后，滴加配好的DAB工作液50 μL于切片上，室温孵育5 min显色。显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色。最后用苏木素复染，各级乙醇(70%～100%)脱水，每级3 min。取出切片置于二甲苯5 min，用中性树胶封片。

1.4 免疫组化结果判读 细胞膜或细胞质内观察到棕黄色颗粒定义为阳性。选取染色均匀的阳性表达区域，统计5个高倍视野下阳性细胞的计数及染色强度。按阳性细胞率，阳性细胞率<5%为0分，6%～30%为1分，31%～70%为2分，>70%为3分；按着色强度分为不着色、淡黄色、深黄色，分别计0、1、2分。将阳性细胞率计分和着色强度计分相加，最终得分0分为阴性(-)，得分1～2分为弱阳性(+)，得分3～4分为阳性(++)，得分5分为强阳性(+++)。SAMHD1表达阳性包括阳性和强阳性。所有判读结果均由两名及以上临床病理医师负责判读，当出现不同的判读结果时，由两名医师协商确认判读结果。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计数资料以例数和百分比表示，比较采用χ2检验；采用Cox风险模型分析患者预后的影响因素；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用log-rank 法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SAMHD1在胃癌组织中的表达情况 免疫组化分析结果显示，SAMHD1在胃癌组织中的阳性表达率高达75.9%(243/320)，见表1、图1。

表1 SAMHD1在胃癌组织中的表达情况

图1 免疫组化分析结果

2.2 SAMHD1表达与临床病理特征的关系 SAMHD1的表达情况与患者的性别和肿瘤原发部位无相关关系(均P>0.05)，但与患者的年龄和临床分期相关(均P<0.05)，见表2。

表2 SAMHD1表达与临床病理特征的关系(n)

2.3 SAMHD1表达与预后的关系 对320例患者进行随访，总体生存时间为手术开始至死亡或随访结束(截止日期2020年7月)，平均随访时间53个月，中位随访时间为65个月。以胃癌术后患者的生存时间作为因变量，以临床上认为对患者的预后有影响的变量(性别、年龄、肿瘤临床分期、SAMNHD1表达情况、肿瘤原发部位)作为自变量，采用Cox比例风险回归模型进行单因素分析，变量赋值情况见表3。结果显示，SAMHD1表达情况、年龄、临床分期、肿瘤原发部位是胃癌患者预后的影响因素(均P<0.05)，见表4。将上述单因素分析中具有统计学意义的变量作为协变量，纳入Cox比例风险回归模型中进行多因素预后分析，结果显示SAMHD1表达情况和临床分期均是胃癌患者预后的独立影响因素(均P<0.05)，见表5。

表3 变量赋值情况

表4 影响胃癌患者预后的单因素Cox 比例风险模型分析

表5 影响胃癌患者预后的多因素Cox比例风险模型分析

2.4 SAMHD1表达阳性患者和表达阴性患者预后的比较 Kaplan-Meier分析结果显示，SAMHD1表达阳性患者的中位生存期为61个月，高于SAMHD1表达阴性患者的中位生存期25个月(χ2=9.147，P=0.002)，生存曲线见图2。

图2 SAMHD1表达阳性和表达阴性患者的生存曲线比较

3 讨 论

胃癌是来源于胃黏膜上皮细胞的一种恶性消化道肿瘤，新发病例数逐年升高[12]。早期胃癌的临床表现无特异性，常以上腹部不适、嗳气、呃逆等为先导症状，容易与胃的良性疾病混淆，使早期胃癌的诊断率下降。由于进展期胃癌死亡率高，5年生存率低于30%，且手术风险大，医疗资源消耗大，因此需要寻找合适的筛查、评估预后的手段[13]。SAMHD1是近年来新发现的一种天然广谱抗病毒基因产物，随着对SAMHD1基因研究的深入，人们发现SAMHD1基因在多种肿瘤疾病中存在不同程度的变异，导致SAMHD1异常表达。在衰老导致的老年肺癌患者中，SAMHD1出现低表达现象[8]，而同样的现象也在肝癌[9]中被证实。研究发现，SAMHD1可通过调控p27来抑制周期蛋白依赖性激酶的活性，使早期肿瘤细胞比例与高表达的p27和SAMHD1水平呈正相关[9]。因此，SAMHD1可能是一种潜在的抗肿瘤蛋白，本研究探讨其在胃癌组织中的表达及其与胃癌患者临床特征的关系，为胃癌的诊断、治疗、发病机制研究提供参考。

本研究中，胃癌组织SAMHD1阳性表达率高达75.9%，且SAMHD1的表达与患者的年龄、临床分期相关(均P<0.05)。Cox比例风险模型分析结果显示，SAMHD1表达和临床分期均是胃癌患者预后的独立影响因素(均P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果提示，SAMHD1表达阳性的胃癌患者的生存期长于SAMHD1表达阴性患者(P<0.05)。以上结果提示，SAMHD1表达阳性是胃癌患者预后的独立保护因素，其独特的抗病毒、调控细胞周期作用，可能也在恶性肿瘤组织中发挥作用。对结直肠癌患者进行研究发现[7]，SAMHD1基因在肠癌中的突变降低了SAMHD1在肿瘤组织中的表达，导致脱氧核糖核苷三磷酸酶不同程度的活性降低，导致dNTP生物降解程度变慢，破坏原有的dNTP池平衡，为肿瘤细胞DNA复制提供充足的dNTP，说明低表达的SAMHDA1是结直肠癌肿瘤生长的促进因素。结合本研究结果，SAMHD1在胃癌肿瘤细胞的生长过程中发挥着与脱氧核糖核苷三磷酸酶相似的作用，可以更好地稳定dNTP池[14]，调控DNA复制的底物浓度[15]，限制肿瘤的生长，进而发挥抗肿瘤作用，影响胃癌患者的预后。另外，SAMHD1可以调控长散布元件基因的表达下游产物开放阅读框蛋白(open reading frame 2 protein，ORF2p)[16]。ORF2p的主要作用是调控DNA的反转录过程，然而，受到SAMHD1影响后，ORF2p在肿瘤细胞中表达下降，从而抑制逆转录转座子的活性，延缓DNA反转录的过程，进而减缓细胞周期，影响肿瘤细胞的生长[17]，这可能是SAMHD1影响肿瘤患者预后的机制之一，但SAMHD1在胃癌发病中的内在机制还需要进一步研究。

综上所述，胃癌组织中的SAMHD1广泛表达，且其与部分临床病理特征相关，SAMHD1表达阳性是胃癌患者预后的独立保护因素。SAMHD1作为一个在多种肿瘤中存在广泛突变的基因，对其进行深入研究，有助于探讨肿瘤内在的发生和发展机制，为早期胃癌的诊断、预后判断提供依据。