表皮生长因子发现者：斯坦利·科恩

郭晓强

石家庄职业技术学院 体育系，石家庄 050081

表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）是一类具有促进细胞生长、增殖、生存和分化等作用的蛋白质，正常情况下可促进伤口愈合、器官再生等生理过程，但过度激活则导致癌症等疾病的发生。EGF的发现可追溯到20世纪60年代，而做出这项奠基性贡献的是美国生物化学家斯坦利·科恩（Stanley Cohen）（图1）[1]。

图1 斯坦利·科恩（1922.11.17—2020.2.5）

蚯蚓的“肝脏”

1922年11月17日，科恩出生于美国纽约市布鲁克林区一个犹太移民家庭。父母于20世纪初从俄国来到美国，父亲是一位裁缝，母亲是一名家庭主妇。尽管他们文化程度不高，但对教育都异常重视。一方面他们向科恩强调知识的重要性，另一方面尽其所能为科恩提供良好的教育环境。

科恩没有辜负父母的期盼，不仅本身智力超群，而且也足够努力，因此成绩一直保持优异，使他得以免费进入布鲁克林学院。大学期间，科恩的主要兴趣是细胞生物学，尤其是关于胚胎发育的奥秘，并且他深刻意识到化学在生物学领域中的巨大应用潜力，初步确定了将来的科研方向。科恩当时的理念是，生物学家单纯通过描述细胞形态很难推动生命科学的真正进步，只有充分掌握化学原理才能真正理解生命的奥秘。

1943年，科恩从布鲁克林学院毕业并获得化学/生物学双学位。尽管十分热爱科研，但他为了积攒足够资金支付学费而进入当地一家牛奶厂工作，负责车间除菌工作。幸运的是，工作没多久科恩就从大学期间的一位老师那里得到信息，他可申请奥伯林学院（Oberlin College）的免费硕士课程。在奥伯林学院，科恩跟随麦克尤恩（Robert McEwen）开展蚯蚓解剖工作，并逐渐对科研产生真正的兴趣。特别是有一次在实验室，麦克尤恩询问科恩，蚯蚓何种细胞与哺乳动物肝脏功能类似？这一问题使科恩无从回答。尽管最终麦克尤恩得出答案，就是蚯蚓肠道中一类特殊细胞，但这一经历对科恩的科研生涯产生深远影响。1945年，科恩从奥伯林学院获得动物学硕士学位。

随后，科恩进入密歇根大学生物化学系跟随刘易斯（Howard Lewis）继续深造。当时生命科学的热点是营养学，就是用不同配比的营养物饲养大鼠或兔子，然后通过分析尿液成分来确定何种氨基酸或其他物质具有营养价值。但科恩认为这些研究缺乏吸引力，他更喜欢做的事是证明麦克尤恩的关于“蚯蚓肠道细胞具有哺乳动物肝脏功能”的论述是否正确。刘易斯尊重科恩的决定，允许他先用半年时间确定这一思路是否可行。

为不负师望，科恩迅速启动自己的研究计划，那就是检测饥饿条件下（利用氨基酸作为营养物质）蚯蚓肠道细胞是否具有生成尿素的能力（哺乳动物肝脏典型功能之一）。为完成课题，科恩需要在大学校园绿地中收集5 000多条蚯蚓，工作量可想而知。科恩对饥饿近一个月的蚯蚓肠道进行清洗，对清洗液利用尿素酶显色实验进行测定，发现有大量尿素生成，并且饥饿时间越长，尿素生成量越大。科恩又进一步将肠道特殊细胞分离后进行体外实验，发现补充底物精氨酸可显著提升尿素的生成。这些结果证明了科恩的预期，也就是蚯蚓肠道特殊细胞与哺乳动物肝脏细胞至少在尿素生成方面具有相似性[2]。科恩凭借这些工作获得博士学位。对科恩而言，这项研究的更大价值在于“能够找到自己感兴趣的研究方向并义无反顾地去做，不必太在意这项研究的重要性”。这一理念也成为科恩后来开展科学研究的指导原则——“兴趣高于一切”。

1948年，科恩获得博士学位后进入科罗拉多大学儿科和生物化学系。由于博士期间代谢研究的经历，他负责早产儿的代谢研究，而其兴趣也从动物学转向代谢。科恩工作一段时间后获悉放射性同位素示踪在代谢通路研究方面具有得天独厚的优势，因此于1952年进入华盛顿大学放射系跟随凯门（Martin Kamen）开展研究，采用同位素示踪研究青蛙卵和胚胎二氧化碳代谢。

当时华盛顿大学英才辈出，聚集了众多有思想的科学家。为更好地推动科学发展，他们组建了一个科学讨论班，成员包括科恩伯格（Arthur Kornberg，1959年诺贝尔生理学或医学奖获得者）、伯格（Paul Berg，1980年诺贝尔化学奖获得者）、科恩和凯门等。讨论班的主要活动就是大家聚集在一起，就当前生命科学前沿或自己的科学思想开展深入讨论。科恩每次都经过精心准备，一方面发表自己的观点，另一方面也从中获取知识，特别是一些科学研究的基本逻辑。他认识到，真正的科学争论结果并非一定产生共识，关键要从中汲取营养为己所用。以DNA双螺旋结构发表后的看法为例，一部分讨论班成员认为是天才想法，另一部分则将它看作纸上谈兵，几无用处。通过耳濡目染，科恩进一步意识到个人认为正确的事情就应义无反顾地继续，而非过多考虑其他人的看法，当然有价值的建议还应采纳。虽然参与科学讨论，但科恩当时尚未形成一个稳定的研究方向，而后来的机缘巧合为他的科研带来新生。

蛇毒的秘密

早在20世纪40年代，意大利女科学家蒙塔尔奇尼（Rita Levi-Montalcini）以鸡胚胎为材料证明胚芽具有神经生长诱导作用[3]。二战后，蒙塔尔奇尼应邀来到美国华盛顿大学汉伯格（Viktor Hamburger）实验室继续研究神经诱导机制，却在进一步的实验中意外发现小鼠肿瘤肉瘤也具有类似功能。由于这一发现意味着神经诱导现象具有普遍性，他们决定探寻这一现象背后的秘密。遗憾的是，蒙塔尔奇尼和汉伯格都不是生物化学家，因此他们去华盛顿大学其他系寻求生物化学背景的“新人”加入研究小组。正处于科研“待业”阶段的科恩就被推荐到这一项目，而拥有生物化学背景的他本身又对胚胎学感兴趣，因此摩拳擦掌准备施展自己的才华[4]。这是一次完美的科学合作！虽然科恩对神经胚胎学了解不多，而蒙塔尔奇尼他们也对生物化学理解不深，但可贵的是，他们能互相信任和尊重，这是保障实验顺利进展的关键。他们对科研内容进行严格分工，科恩负责活性物质的纯化和本质分析，蒙塔尔奇尼负责检测纯化物的生理活性。

科恩采用经典生物化学纯化方法，首先将肿瘤细胞碾磨，然后进行初步分离。由于当时层析分离法尚不普及，研究人员通常采用高盐沉淀法制备粗提物，并将不同分离物进行神经生长活性检测，从而鉴定出具有促神经生长的粗提物成分。科恩对其生物本质进一步分析后发现，该物质不耐热，无法透过半透膜，并且使用蛋白酶处理可导致失活，因此推测是一类蛋白质性质的分子。在将这一结果进行科学讨论时，科恩伯格给科恩提出一个重要建议，使用磷酸二酯酶处理且破坏所有核酸后检测其生理活性[5]。

科恩将从蛇毒中提取的磷酸二酯酶加入肿瘤粗提液，在反应一段时间后检测神经诱导活性。结果出乎意外，肿瘤粗提液活性不仅没有减弱，反而促进作用更强。科恩最初认为磷酸二酯酶破坏了肿瘤粗提物中的抑制性成分，但进一步研究发现，单纯使用磷酸二酯酶也可促进神经生长。真相原来是蛇毒来源的磷酸二酯酶不纯，其中含有活性更好的促神经生长的物质。因此，科恩转而从蛇毒中提取活性物质，并将其命名为神经生长因子（nerve growth factor,NGF）。

科恩基于自己的科研经历推测，既然蛇毒由蛇的唾液腺分泌，理论上哺乳动物对应物也应有类似功能，因此他收集了一只雄性小鼠的唾液腺，然后将其碾碎制备提取物。体外实验表明科恩这个设想完全正确，小鼠唾液腺提取物体外确实具有神经生长促进能力。下一步是体内实验，即使用小鼠唾液腺粗提物注射到小鼠体内。部分结果符合预期，小鼠神经发育确实得到改善；同时也出现意想不到的结果，小鼠牙齿提前长出和眼帘提前打开。后来科恩幽默地描述当时的情形：我静静观察着这些出生不久的小鼠，而可爱的小家伙也懵懂地注视着我，大家都在疑惑故事原本不应该这样。科恩随后使用蛇毒粗提物重复小鼠体内实验，但并未观察到小鼠牙齿提前长出和眼帘提前打开的现象，从而说明小鼠唾液腺除NGF外还应存在其他活性成分，而正是这些成分促进小鼠异常表现[6]。

雄鼠唾液腺促生长成分

1959年，科恩离开华盛顿大学到范德堡大学（Vanderbilt University）生物化学系担任助理教授，继续研究小鼠牙齿提前长出之谜。科恩进一步采用最新的层析分离法从小鼠唾液腺纯化到一种活性成分——该成分不能透过透析膜，具有抗原性等特征，表明是一种蛋白质。最初该活性成分被命名为“牙齿-眼睑因子”（tooth-lid factor）[7]，但深入研究发现该因子生理功能实际上通过促进表皮细胞增殖实现，因此重新命名为表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）[8]。随着生命科学的快速发展，科恩开发出快速纯化小鼠EGF的方法，最终于20世纪70年代初获得足够量的高纯度EGF，并采用蛋白质测序方法确定一级结构：其由53个氨基酸残基组成，内部有3对二硫键（图2a）[9]。

图2 科恩的科学贡献：（a）小鼠EGF一级结构；（b）EGF作用机制；（c）EGFR结构；（d）HER2临床应用

科恩对小鼠EGF体外功能进行了广泛研究，发现其不仅对小鼠细胞具有促增殖作用，而且对人成纤维细胞也具有活性。基于此，科恩推测人类也应存在EGF。由于人无法像小鼠那样摘取唾液腺，科恩将目光转向无创尿液，并最终在人类尿液中发现EGF。人和小鼠的EGF高度同源，均具有促进细胞生长和增殖等能力。这一发现一方面证明进化上的保守性，另一方面也暗示其普适性。

科恩随后考虑下一个关键问题，那就是EGF促进细胞增殖的分子机制。按照当时的主流观点，细胞膜上应存在特异性识别EGF并传导其活性的受体（receptor）。科恩研究发现，EGF在体外确实可与人成纤维细胞可逆性结合，部分结合的EGF可启动受体介导的内吞，最终在溶酶体内被降解。科恩还进一步使用从癌细胞制备的细胞膜组分确定细胞表面确实存在大量EGF受体（EGFR），这些受体结合EGF后首先引发自身磷酸化，然后进一步磷酸化细胞内中介蛋白，最终实现细胞增殖效应（图2b）。最初EGFR被认为是一种传统的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，但后来被纠正为赖氨酸蛋白激酶。EGFR结构主要包括三部分：细胞外为特异性识别EGF的部分，中间为跨膜结构，细胞内为活性结构（磷酸化）（图2c）。

与科恩寻找EGFR同时开展的工作是鉴定癌基因。结构分析意外发现，一类癌基因与EGFR具有高度同源性，从而殊途同归，即正常EGFR具有促进细胞增殖的活性，而癌基因的功能在于促进恶性转变、失控增殖的效应。这一发现为癌症治疗提供了重要思路。人类共有4种生长因子受体，分别命名为HER1～4，它们的功能异常均与癌症发生有关，其中HER1和HER2最为关键，HER1功能获得性基因突变（激酶过度激活）是引起非小细胞肺癌的常见原因，而HER2基因扩增（产生过量HER2分子）是乳腺癌的发生原因之一。这些特征为癌症靶向治疗提供了重要思路。临床上常用的HER1小分子抑制剂易瑞沙和特罗凯在治疗肺癌方面取得理想疗效，而HER2单克隆抗体赫赛汀（Herceptin）更是成为治疗乳腺癌的神奇药物。赫赛汀能够有效降低乳腺癌复发风险，提升患者生存质量和延长生存时间，已为几百万乳腺癌女性带来福音[10]。在赫赛汀开发中做出卓越贡献的三位科学家（H.Michael Shepard、Dennis J.Slamon和Axel Ullrich）也因此分享了2019年美国拉斯克临床医学研究奖。

“生长因子”一词是指天然的蛋白能刺激细胞增殖和细胞分化。生长因子具有调节细胞各类活动的功能，通常分泌到细胞外充当细胞间的信号分子。生长因子结合到靶细胞表面的特异受体上，通常促进细胞分化和成熟。当然，因生长因子不一，其功能也多样。例如，骨形成蛋白刺激骨细胞的分化，而血管内皮生长因子刺激促进血管内皮细胞增殖。

NGF和EGF的发现开创了一个全新的研究领域，随后大量生长因子被发现，著名的如成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）、血小板来源生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）、类胰岛素生长因子-1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）等，同时它们的相应受体也被鉴定成功。这些受体具有类似结构，统称为受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase,RTK）。这些进展一方面拓展和深化了对诸多生命现象的理解，另一方面还具有广泛的应用价值。目前最主要的一类小分子靶向药物都是这些受体酪氨酸激酶的抑制剂[11]。生长因子的研究历程充分说明了国家对基础科学资助的重要性。

永葆初心

随着生长因子重要性的不断体现，科恩获得的科学奖项也接踵而来，主要包括1985年加拿大加德纳奖（Gairdner Foundation International Award）、1986年美国拉斯克基础医学奖、1986年与蒙塔尔奇尼分享的诺贝尔生理学或医学奖、1986年的美国科学奖章，在重大科学奖项方面称得上大满贯。

1999年，科恩从范德堡大学退休，但仍以荣誉教授的身份经常回校参与科学讨论，积极鼓励和支持年轻科研人员的发展。他还热衷于参加公众科普，一直强调科研兴趣要从娃娃抓起，鼓励高中生从事科学探索。科恩还拥有丰富的业余生活，尽管因儿时患小儿麻痹而造成腿脚不便，但仍坚持体育运动，尤其热爱网球。

2020年2月5日，科恩在美国田纳西州首府纳什维尔（Nashville）一家疗养院去世，享年97岁[12-13]。范德堡大学医学院院长巴尔泽（Jeff Balse）对科恩的成就评价为：EGF的发现为多个生命学科的发展奠定了坚实的工作基础，深化了对多种疾病的理解和认识，尤其在改变全球数百万癌症患者治疗效果方面更是功不可没。

科恩是一位纯粹的科学家，从未想过成果转化，研究出发点完全是好奇心和个人兴趣。当然，这也与二十世纪六七十年代的科学氛围有关。科恩几十年来的科研申请目的就是探索表皮生长因子的结构、作用和分子机制，未提及应用，但仍得到持续的支持。今天的科研活动过于看重实际转化和商业价值，反而淡化了科学的目的在于探索自然界奥秘这一重要使命。在科学目标越来越功利化的今天，科恩式的纯粹科学家越来越少，因此其精神更显弥足珍贵。

科恩比较推崇 “小作坊式”的科研模式，自己带着几个人的小团队（包括研究生、博士后和技术员等）孜孜不倦探寻EGF的奥秘。在这种模式下，科恩高度强调偶然性在科学发现过程中的重要性，因为许多结果无法提前预测。2007年，科恩在与高中生的一次对话中提到“许多新事物都是偶然发现”。科恩还以自己研究NGF和EGF的历程进行说明，从肿瘤细胞到蛇毒再到小鼠唾液腺，有时一个不经意的选择就可能带来完全不一样的结果。科恩回忆自己进行小鼠唾液腺提取实验时选的是雄性小鼠，这个选择至关重要，因为后来发现雄性小鼠唾液腺中EGF水平明显高于雌性小鼠，这就意味着当时如选择雌性小鼠唾液腺，那么由于含量低而现象不明显，最终可能错失这一重大发现。因此，科学发现的很多历程可用“有心栽花花不开，无心插柳柳成荫”来描述。

科恩总结做科学家的四大要素：挚爱学习、善于沟通、不怕提问、兴趣驱动。尽管科恩做出卓越的科学贡献并获得诺贝尔奖，但由于谦逊的性格和低调的处事风格，其知名度不是太高。对于生命科学领域的人士而言，提及科恩大家可能更多地想到另一位科学家——基因工程奠基人斯坦利·诺曼·科恩（Stanley Norman Cohen）。因此，撰写此文的目的在于加深对这位斯坦利·科恩科学贡献的理解和认识。