核-壳结构复相生物活性陶瓷微球优化制备及其抗菌性能评价

叶 硕，吴方汇，柯秀荣，王晓清，刘梦涛，杨贤燕，张 雷，苟中入，杨国敬

(1.温州医科大学附属第三医院暨瑞安市人民医院，浙江 瑞安 325200；2.浙江加州国际纳米技术研究院，浙江大学，浙江，杭州 310058)

1 前 言

长期以来，感染性骨缺损因其慢性炎症长期迁延及局部感染反复出现而导致修复缓慢，一直困扰着骨科临床[1-2]。目前临床常规的骨移植、人工材料填充修复在治疗感染性骨缺损方面均存在诸多局限性，尤其是难以在病变修复、感染控制及诱导新骨再生功能需求问题上获得突破[3]。通常，感染情况下的骨再生修复效率主要取决于植入物对感染的高效控制，以及由植入物释放活性物质、植入物的多孔网络空间演化推进，使得新骨再生与长效抗感染的协同[4]。

生物活性陶瓷的活性不仅体现在表面诱导类骨矿物沉积方面，并且降解释放的多种无机离子在活化成骨相关细胞响应[5]与感染防控[6-8]发挥了重要作用。其中，磷灰石陶瓷不仅能传导骨生长，精确构建的特定表面微纳结构还能诱导异位成骨[9]，但是该材料在生理环境中十分稳定，降解极为缓慢，难以实现骨缺损高效并完全再生修复[10]。生物活性玻璃虽然显示出良好的生物降解性，其表面还可以维持细胞粘附、生长。并且降解溶出的无机离子组合物能显著促进成骨细胞增殖和成骨分化[11-12]，但是其存在易脆、加工成形难等问题。近年来一些含镁的钙-硅基生物陶瓷，如透辉石(CaMgSi2O6)、镁黄长石(Ca2MgSi2O7)，被证实具有良好成骨活性[13]，在模拟体液中能较快地诱导类骨磷灰石矿物沉积，在体内与骨组织能形成骨性键合[14]。

迄今，生物陶瓷材料修复感染性骨缺损已取得了很大进展，但是人们对该类材料的生物活性效应认知，往往局限于是否有利于改善骨再生效率，对骨骼内的感染控制等“边际需求”重视有限[15-16]，这极大地制约了该类材料在病理环境下的应用。近年来的一些研究证实，通过掺入一些离子如锌、铜、锶、硒、硒等，能够改善生物陶瓷材料的降解性或生物活性，并且在促进骨再生方面起到一定的改善作用。更为重要的是，某些无机离子在抗感染、控制炎症与抗肿瘤活性等方面显示出独特生物学效益。譬如，中澳两国学者的合作研究发现，铜掺杂介孔生物活性玻璃可以促进血管化效应，并产生良好的抗菌性[17]；同时铜掺杂生物活性陶瓷或修饰人工关节涂层，能高效控制感染和抑菌[18]。

据此，此次实验拟利用自主设计的同轴双喷头微球制备系统，通过具有高效抗感染活性的铜元素低剂量选择性掺杂，构建组分分布可调、内部微孔和降解速率可控的核-壳结构型多孔性生物活性陶瓷微球，以期实现该类微球材料抗菌活性成分的可控缓释，从而构建有利于感染性骨缺损高效修复的新型活性材料。

2 实 验

课题组自行设计的生物陶瓷微球制备系统(图1)，具有同轴核-壳结构双层喷头和微流控系统，可以同步实现不同层的组成成分分布的自主调节以及微观结构的精确剪裁，以期获得生物陶瓷微球的无机离子释放剂量水平和颗粒尺度阶段性可调控功能。

图1 A: 同轴核-壳结构双层喷头结构示意图；B：核-壳结构多孔性生物活性陶瓷微球示意图；C: 核-壳结构生物陶瓷微球的制备流程图

实验用试剂有：分析纯的海藻酸钠(NaAlg)；造孔剂为单分散聚苯乙烯微球(Polystyrene，PS)，粒径为15 μm左右，所需相关试剂均为外购。

2.1 生物活性陶瓷粉体材料制备

首先，制备镁部分取代钙(取代率6%)的非计量比硅灰石粉体(记为Mg6)：分别配制硝酸钙-硝酸镁混合溶液和硅酸钠溶液，将混合溶液的pH值调至10.0左右后，逐滴加入到持续搅拌的硅酸钠溶液中，待滴加结束后继续搅拌陈化12 h以上，然后对沉淀溶液抽滤，用去离子水和无水乙醇对白色沉淀物各洗涤3次，再进行干燥和850 ℃煅烧处理，最后将得到的Mg6粉体在乙醇介质中球磨6 h，获得颗粒度不超过10 μm的超细粉体。其次，按类似步骤制备铜取代钙离子分别为4%和10%的非计量比硅灰石粉体(记为Cu4、Cu10)，即将硝酸铜替换硝酸镁，其它合成步骤和工艺条件不变，对制备所得的Cu4、Cu10粉体进行球磨处理，制备得到颗粒度不超过10 μm的超细粉体。

2.2 核-壳结构生物活性陶瓷微球制备

将9 g生物陶瓷粉体(Mg6、Cu4、Cu10)加入到20 mL 含5% NaAlg的水溶液中，充分搅拌使粉体均匀分散后形成糊状物。然后，利用图1所示的陶瓷微球制备核-壳喷头及储料装置，将上述糊状物分别装于与核、壳层喷头链接的储料泵，启动蠕动泵将糊状物从核-壳结构喷头挤出，从而形成核-壳结构的浆料微滴。一旦微滴滴落到含硝酸钙的接收液中，利用海藻酸根与钙离子的螯合交联作用迅速硬化成型，浆料微滴的微球颗粒形态得以维持。从而可以制备出由Cu4、Cu10为核层、Mg6为壳层的核-壳结构微球，分别记为Cu4@Mg6和Cu10@Mg6。

与上述步骤类似，向壳层浆料中预先均匀混合PS微球造孔剂(直径为15 μm)，且保持陶瓷粉体与造孔剂的质量比为6∶1，按类似步骤和过程可以制备得到壳层含量高密度微孔道的核-壳结构微球，并记为Cu4@Mg6-15 μm和Cu10@Mg6-15 μm。

将上述各种微球持续浸泡2 h后，再用去离子水洗涤3次，然后依次在60 ℃干燥12 h和1120 ℃烧结3 h，烧结过程的升温速率为3 ℃/min。待随炉温降至室温后，得到各种核-壳结构型硅酸钙陶瓷微球材料。

2.3 微球的成分与结构的测试与表征

使用数码相机(Leica)对微球外观进行拍照，采用游标卡尺和电子显微镜(SEM，Ultra 55)分别测量烧结前后的微球粒径和观察其断面微结构特征，采用X射线衍射(XRD，MaxRC)仪分析评估烧结后的陶瓷微球样品的物相组成，采用电感-火焰等离子体发射光谱法(ICP-OES，iCAP 6000 series)测试粉体中Cu、Mg、Ca等元素的含量。

2.4 体外降解及离子释放实验

各种核-壳结构陶瓷微球分别称取0.20 g样品并分别加入10 mL Tris缓冲溶液中(pH～7.25)，放入37 ℃恒温箱。在预定时间点各取1.0 mL浸泡介质的上清液，加入到9.0 mL稀盐酸溶液中，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OMS)测试浸泡样品上清液中的Ca、Cu、Si和Mg浓度。浸泡4周后取出微球样品，用去离子水、无水乙醇各洗涤3次，放入80 ℃烘箱中干燥处理，然后称量，根据浸泡前、后的微球质量变化，借助公式计算其质量失重率。

2.5 体外抑菌实验

体外抑菌实验分两种方案进行。方案1(体外接触抑菌试验)：制好5份固体琼脂培养基，用100 μL 移液枪均匀吸取10 μL金葡菌悬液并在塑料试管中稀释10倍，取100 mL稀释菌液滴于各个琼脂培养基上，取涂布棒放于酒精灯灯焰上灼烤15～20 s充分灭菌，再用100 μL移液枪均匀吸取100 μL稀释菌液并滴加于培养基上，用涂布棒将稀释菌液均匀涂抹于固体琼脂培养基表面。取等量核-壳结构(Cu4@Mg6-15 μm，Cu10@Mg6-15 μm)及壳-核结构(Cu4@Mg6，Cu10@Mg6)为实验组，以Mg6@Mg6为对照组，并依次放置于各相应培养基上，然后用移液枪依次吸取等量PBS缓冲液并滴于微球表面，直至PBS溶液完全淹没微球。通过定期滴加PBS缓冲液持续微球表面湿润，在预定时间点观察铜掺杂微球抑菌效果。

方案2(微球浸出液抑菌实验)：准备10份固体琼脂培养基，备用。分别向10 mL容量塑料试管中加入10 mL灭菌蒸馏水，再用100 μL移液枪吸取金葡菌菌液10 μL注入该试管中，充分震荡混匀，使金葡菌菌液稀释。然后，分别吸取100 μL稀释菌液依次滴加在各个琼脂培养基上，再取涂布棒炙烤15～20 s充分消毒后，用其将菌液均匀涂抹于培养基上，再培养24 h后取出，备用。

准备10份PBS微球浸出液，具体步骤为：分别取0.20 g 5种陶瓷微球加入到10 mL PBS溶液中，并在37 ℃下分别浸泡24和72 h，取出微球，备用。将分别浸泡微球24和72 h后的各5组PBS浸出液加入到琼脂上特定的细胞接种区域(见图6)，即可得到10份不同分组的琼脂培养基，并将这些培养基放置于37 ℃恒温箱内培养，次日依次观察各组琼脂培养基上的细菌生长情况。同时，各组的PBS浸出液均取0.5 mL上清液，加入9.5 mL稀盐酸稀释20倍后用于送样，检测微球PBC浸出液中Cu离子的浓度。

2.6 体外细菌黏附实验

向250 mL小烧杯中加入100 mL蒸馏水，再加入0.25 g肉汤琼脂粉末，充分搅拌、溶解后将该肉汤琼脂溶液高压灭菌处理20 min，备用。用无菌注射器抽取2 mL无菌肉汤培养液依次等量加入到5组10 mL塑料试管里，用100 μL移液枪均匀吸取10 μL金葡菌悬液并在试管中稀释10倍备用，用移液枪吸取100 μL金葡菌稀释菌液依次等量滴加于上述5组试管中，再取5种微球各5粒，依次等量加入到对应的含有肉汤培养液的试管中，将试管放于37 ℃恒温培养箱内静置培养。3天后取出5支试管，用无菌塑料吸管依次充分吸干5支试管内的肉汤培养液，然后再依次往试管内加入若干戊二醛溶液使之淹没微球，之后将这5支试管放入4 ℃冰箱静置24 h，充分固定金葡菌。最后，用镊子依次夹出5支试管里的微球，用吸水纸充分吸尽微球表面的戊二醛残留液，待微球充分干燥后，使用SEM观察微球表面的细菌黏附情况。

3 实验结果

3.1 形貌观察和微结构分析

从图2可见，实验所制的陶瓷颗粒呈球形，颗粒尺寸较均匀。将干燥后的微球沿纵轴切开，可见微球内部核层、壳层的界限层次分明，并且干燥后各组颗粒的球形形态保持稳定。烧结后，各组微球均发生了收缩，如图2(B～F)可见烧结微球烧粒径均在2～3 mm之间，单相微球、核-壳结构微球及壳层造孔的微球在烧结中球形形态维持良好，各组微球粒度为(2.5±0.2)mm。

图2 (A)核-壳结构陶瓷微球烧结前大体外观及其剖面图;(B～F)1120 ℃煅烧后核-壳结构微球外观图，分别为Mg6@Mg6、Cu4@Mg6、Cu10@Mg6、Cu4@Mg6-15 μm及Cu10@Mg6-15 μm

图3为陶瓷微球颗粒断面形貌和微观结构。从图可见，陶瓷微球整体截面的宏观形貌差异并不大，可能是5种陶瓷微球核-壳层组分均为硅灰石，因而难以观察到Mg、Cu的掺杂所引起的细微差别。事实上，烧结后各组分晶粒形貌类似，因而难以观察到文献所述[30]的核-壳层因烧结收缩造成的间隙。从图3(D2、E2)观察可知，引入PS微球造孔剂会在壳层内形成大小均一、形态较为一致的圆形孔隙。从图3(A2-E2)对比观察发现，两组经造孔的陶瓷微球较其他未造孔的三组陶瓷微球的壳层结构也更为疏松，表明造孔剂加入达到了壳层微孔调节的目的。总之，通过SEM观察表明，同轴核-壳喷头系统可以制备出具有良好球形形态的核-壳结构非计量比硅灰石生物陶瓷微球，并且特定组分内部微结构可调可控。

图3 1120 ℃煅烧后的不同放大倍数元素掺杂核-壳结构生物陶瓷微球的断面扫描电镜图片(A1～A3:Mg6@Mg6；B1～B3：Cu4@Mg6；C1～C3: Cu10@Mg6；D1～D3：Cu4@Mg6-15 μm；E1～E3: Cu10@Mg6-15 μm)

3.2 核壳结构生物活性陶瓷体外降解行为分析

图4为多种陶瓷微球的体外降解离子释放测试结果。如图4A所示，从Ca释放速率可见，Mg6@Mg6显示出最快的降解速率，Cu掺杂的硅灰石核-壳结构陶瓷微球(Cu4@Mg6和Cu10@Mg6)则显著抑制了硅灰石的降解速率。从Si的释放浓度变化也表明纯硅灰石核-壳结构陶瓷微球(Mg6@Mg6)表现出较快的降解速率，Cu掺杂的核-壳结构陶瓷微球(Cu4@Mg6，Cu10@Mg6)的Si释放则较为缓慢(图4B)。另一方面，随着Cu掺杂取代率的增加，从核-壳结构微球中释放Cu离子浓度增大则更为快速，装有Cu10@Mg6的缓冲液中Cu离子释放浓度增大较快(图4D)。同时，对比Cu4@Mg6和Cu4@Mg6-15 μm，Cu10@Mg6和Cu10@Mg6-15 μm，后者都表现出了更快的Cu2+释放速率，这是由于壳层经造孔后，其质地相较于致密微球更为疏松，降解更快，同时其核层组分与模拟体液接触面积更大，共同促进了其核层Cu2+高效释放。再次，通过核-壳结构设计的的Cu4@Mg6、Cu10@Mg6则能够稳定地释放Mg离子，尽管其释放速率低于Mg6@Mg6(图4C)。由此表明，Cu掺杂核-壳结构陶瓷微球能够控制其降解速率，并且Cu掺杂取代不同的陶瓷微球能够进一步调节壳层关键组分的降解速率。

图4 各组微球在Tris-HCl缓冲液内浸泡的离子释放浓度曲线图，分别为(A)Ca2+;(B)Si2+;(C)Mg2+;(D)Cu2+

依据体外浸泡实验结果分析，对该系列壳层造孔和非造孔的各组核-壳结构型陶瓷微球进行系统的体外抑菌实验研究。采用将微球置于金黄色葡萄球菌菌株平板中进行直接接触抑菌法来评价微球的抑菌能力。将培养1～5天后对抑菌圈后进行拍照，如图5所示。从肉眼观察可见，各组微球均未见出现明显抑菌圈，综合分析考虑主要是因为在较干燥的条件下不利于Cu、Mg等活性离子的持续及有效释放。

图5 不同组别核-壳结构生物陶瓷微球直接接触抑菌实验，所用细菌为金黄色葡萄球菌

微球PBS浸出液抑菌实验结果(见图6)显示，将壳层造孔和非造孔的各组分别浸泡在PBS缓冲液中一段时间后得到的各组浸出液以用于抑菌，均显示出程度不一的抑菌性能。同时各组浸出液Cu离子浓度送样结果表明：Mg6@Mg6浸出液的Cu离子浓度为0，Cu4@Mg6浸出液的Cu离子浓度为20 mg/L，Cu10@Mg6浸出液的Cu离子浓度为32 mg/L，Cu4@Mg6-15 μm浸出液的Cu离子浓度为26 mg/L，Cu10@Mg6-15 μm浸出液的Cu离子浓度为50 mg/L。从图6还可见，各组滴加浸出液的区域均出现了一个明显的圆形圈，不同的是滴加了Mg6@Mg6的微球在24和72 h地圆形圈内部均有明显的细菌长入。但是，Cu掺杂的各组微球在24 和72 h均出现了大小不一的较为明显的抑菌圈。进一步分析可知，壳层未经造孔时，其浸出液显示出较为相似的抑菌效果，但均明显劣于外壳层造孔组。对于壳层造孔的微球组，在24和72 h后皆可见铜掺杂含量更高的Cu10@Mg6-15 μm微球获得了最佳的抑菌效果。因此，通过对微球核心掺铜量及外壳层微孔结构的调控，可有效介导材料抑菌离子的释放。

图6 不同组别核-壳结构生物陶瓷微球PBS浸出液抑菌实验结果

从图7可见，Mg6@Mg6微球表面可观察到大量呈葡萄串珠样黏附于其表面的金葡菌，颗粒边界分明，分布密度很大。在SEM高倍镜下愈加可清晰地见到该组微球的局部长满了颗粒分明，边界清晰的金葡菌。对比观察其他实验组，在较低倍镜下Cu4@Mg6表面黏附的金葡菌数量显著少于Mg6@Mg6组，并且从分布密度上相比较亦可看出Cu4@Mg6表面菌落较稀疏。对比Cu10@Mg6和Cu4@Mg6发现，前者表面金葡菌黏附密度更低，表明核层掺杂的Cu2+含量越高，抑菌效果越好。将Cu4@Mg6-15 μm和Cu10@Mg6-15 μm微球组与其他组微球对比可见，这两组微球上表面仅有少量细菌黏附生长，侧面则几乎无细菌黏附，表现出较强的抑菌能力，进一步证明了壳层造孔的Cu掺杂陶瓷微球具有更佳的抑菌效果。

图7 体外抑菌实验金黄色葡萄球菌微球黏附情况电镜扫描图(上两行为正面观，下两行为侧面观)

4 实验讨论

骨损伤修复材料的生物活性和降解性是影响骨再生修复效率的重要因素。近年来很多研究证明某些钙-硅基生物陶瓷表现出显著优于钙-磷基陶瓷的骨传导活性和骨生成活性，并且能调节免疫反应和介导血管、新骨高效再生[19]，降解的无机离子组合物对骨髓间充质干细胞(BMSCs)产生诱导活性效应，显著促进内皮细胞增殖及多种血管化细胞因子的高效表达[20]；如果添加ZnO、CuO等成分，还能够调控创伤内的炎性反应并防控感染[21-22]。一些含镁的钙-硅基生物陶瓷，如透辉石、镁黄长石被证实具有良好成骨活性[23]，本课题组在前期研究中也发现利用掺镁工艺可以避免硅灰石过快降解并且能够显著提高材料的力学强度[24]，因此，如何有效地利用钙-硅基生物活性材料的生物学功能，并且利用Cu2+优良的抑菌能力，通过核壳组分选择性Cu2+、Mg2+掺杂思路，可以巧妙地实现Cu2+释放速率的控制以及发挥抗感染功能。

人工材料的孔道微结构特征直接影响骨再生效率。以冰晶模板法、三维打印技术等对孔尺度或者力学性能可调性方面各有优势，甚至有利于研究孔尺度与血管化、骨再生发生之间的关系[25-26]。但是，这些制备工艺因难以对陶瓷孔道壁的降解速率进行动态剪裁及生物活性精细调控。而球形堆砌体可形成完全贯通的多孔孔道，并有利于养分传输、细胞迁移、血管化等[27]。国内外学者也相继制备出几种磷酸钙、硅酸钙盐陶瓷微球，并在骨修复、治疗性药物缓释等方面开展了研究[28-29]。但是依据球形紧密堆积理论，相同尺度的微球堆砌体孔隙率往往比较有限(≤32%)，而且常规高温烧结的陶瓷微球，骨缺损内较为稳定，降解缓慢，则会出现孔道拓展效率缓慢和骨再生效率低下等问题。在前期研究中采用自主设计的微球制备装置，成功建立了多层化复相陶瓷微球制备的技术方案，制备了具有阶段波动性降解特征的系列核-壳机构生物活性陶瓷微球[30]。本研究升级了同轴核-壳结构双层喷头及微流控系统，并通过异质离子Cu、Mg选择性掺杂和外壳层造孔等技术方案，成功实现了该类微球材料核心层抗菌活性离子的可控缓释。

作为骨缺损填充材料的陶瓷微球，其内部的微观结构诸如内部介孔结构、孔隙贯通率、孔隙大小等均对材料的降解性能及促成骨能力有重要影响[31]。理论上，具有多孔结构的微球材料相比致密微球材料，与体液接触面积大，离子溶出速度加快，同时微球外部的微孔结构有利于吞噬细胞吸附，加速陶瓷材料降解[32]。这次研究深入探讨了微球的颗粒度、各层微结构及组成成分、外壳层造孔等参数对无机离子释放剂量的调控作用规律，发现掺镁硅灰石壳层微孔结构剪裁可以增加核心层铜离子等抑菌成分释放，因而Cu10@Mg6-15 μm的铜离子释放得以进一步加速，并最终获得了最佳的长期抑菌效果。

以Cu4@Mg6、Cu10@Mg6、Cu4@Mg6-15 μm和Cu10@Mg6-15 μm为实验组，以Mg6@Mg6为对照组，在直接接触抑菌实验中，各组微球均未见明显抑菌圈出现，初步分析表明干燥条件下不利于铜离子释放。反之，将各组微球浸出液进行抑菌分析，含铜离子浸提液组均出现了一个明显的抑菌圈，但是Mg6@Mg6微球在第3天仍旧有细菌长入并最终完全覆盖培养皿。进一步通过细菌黏附实验分析还发现，壳层含有高度微孔的Cu4@Mg6-15 μm和Cu10@Mg6-15 μm表现出了优良的抑菌效果，与其他组微球对比可见，该两组微球上表面仅有少量细菌黏附生长，侧面则几乎无细菌黏附，可见优化外壳层的多孔结构比单纯提高核层铜离子掺杂率更有利于活性离子释放。

总之，球形颗粒陶瓷材料具有易于塑形，植入便捷等优势，并且其堆积体内含有完全贯通的孔道，有利于活性离子释放、成骨相关细胞迁移和新骨长入[33]，本研究对于临床上各种类型的感染性骨缺损治疗修复具有重要的意义。不仅如此，该类陶瓷微球材料缓慢降解所释放Cu2+已被广泛证实具备较强的促进血管化和抑菌能力[17-18]，可有效抑制多种细菌的增殖，长期抗感染性能突出，同时较低剂量的铜元素对人体的影响也甚微，这些优良的生物学功效为该类生物陶瓷微球材料治疗难治性感染性骨缺损奠定了基础。

5 结 论

本研究通过同轴核-壳陶瓷微球制备系统制备出核-壳结构生物活性的陶瓷微球，并结合有机超细微球致孔工艺，在陶瓷微球的壳层成功构建出具有一定抑菌性能的微孔结构，制备得到的陶瓷微球尺寸均一，球形形态良好。同时，体外抑菌实验和微球细菌黏附实验证实Cu10@Mg6-15 μm获得了最佳的抑菌效果。本研究构建的壳层微孔调节的核-壳结构型陶瓷微球，能够帮助解决抗感染离子可控缓释以及长期抑菌的优良效果，为骨科临床上棘手的感染性骨缺损的治疗提供了新的材料和解决方案。