白藜芦醇调节TLR4/NF-κB信号通路影响人前列腺癌PC3细胞株凋亡的研究*

冉亨勇，蒲 军，李明辉，何 毅

(1.邛崃市医疗中心医院肿瘤科，四川邛崃 610000；2.西南医科大学附属医院泌尿外科，四川泸州 646000)

白藜芦醇(Resveratrol，Res)化学名为3，4′，5-三羟基-1，2-二苯乙烯，是一种天然抗氧化物和环氧合酶(cyclooxygenase，COX)抑制剂。Res在预防慢性炎性疾病、抗冠心病、癌症预防等方面发挥重要作用[1]，其机制与清除自由基，抑制COX-2表达，诱导一氧化氮合成酶合成，抑制脂氧合酶与蛋白激酶C表达，抑制脂质过氧化等有关[2]。男性前列腺癌发病率较高，美国前列腺癌发病率位居男性肿瘤第2位，我国前列腺癌发病率也较高[3]。炎症与前列腺癌的发生密切相关，急性或慢性炎症不仅会导致癌变，还参与前列腺癌进展[4]。Toll样受体(toll-like receptor，TLR)是人体参与炎症的主要受体，其中TLR4能诱导肿瘤细胞释放多种细胞因子或上调抗凋亡信号等一系列效应[5]。TLR4信号通路参与前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤的发生、发展过程，主要与促进肿瘤细胞的抗原性、增强机体对其免疫清除能力、促进肿瘤细胞增殖、免疫逃逸、凋亡抵抗和侵袭能力等有关。已有研究报道，TLR4在人前列腺癌PC3细胞中通过核因子-κB(NF-κB)信号通路促进血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素(IL)-8的分泌，影响人前列腺癌PC3细胞的生存[6]。尽管Res对前列腺癌有防治作用，但较少有研究探讨其影响前列腺癌细胞凋亡的作用与调节TLR4/NF-κB信号通路的关系，故本研究探讨Res是否通过抑制TLR4/NF-κB信号通路有关蛋白和炎性因子表达影响前列腺癌细胞凋亡，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI1640培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)，Res(成都普思生物科技股份有限公司)；TAK242(美国Sigma公司)；CCK-8试剂盒、Hochest33342荧光染色试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；兔抗人β-actin、TLR4、NF-κB、Bcl-2、Bax单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(英国Abcam公司)；IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与分组

人前列腺癌PC3细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所，选用RPMI1640培养基，加入10%胎牛血清后在37 ℃、5%CO2条件下常规培养。Res纯度为99%，超声助溶于超纯水中。实验取对数生长期细胞，将细胞分为阴性对照组，Res高、中、低剂量组，TLR4阻断剂组。阴性对照组细胞常规培养，不做其他处理；Res各剂量组分别给予40、20、10 μmol/L Res处理48 h；TLR4阻断剂组给予1 μg/mL TAK242处理48 h。

1.2.2CCK-8法检测Res对人前列腺癌PC3细胞株细胞增殖的影响

细胞常规胰酶消化后制成悬液，调整细胞数为1×106/L，将细胞接种于96孔板中，每孔90 μL，在37 ℃、5%CO2条件下常规培养48 h，细胞处理后每孔加入CCK8试剂10 μL继续培养1 h，酶标仪450 nm波长下检测各孔吸光度值(A值)，计算细胞生长存活率，细胞存活率=A给药组/A阴性对照组×100%。

1.2.3Hochest33342荧光染色检测人前列腺癌PC3细胞株细胞凋亡

收集细胞悬浮液于1 mL培养基中，加入10 μL Hochest33342储存液(100 mg/L，蒸馏水溶解)，染色15 min；将细胞置于冰上冷却后，离心，去上清液，将细胞重悬于1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，加人5 μL碘化丙啶(PI)储存液(1 g/L，蒸馏水溶解)，混匀，避光放置10 min后荧光显微镜观察。

1.2.4Western blot检测人前列腺癌PC3细胞株TLR4、NF-κB、Bcl-2及Bax蛋白表达

细胞处理后弃上清液，每孔加入50 μL裂解液裂解细胞，提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度，计算样品加样量。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶，每孔上样20 μL，100 V电泳90 min，200 mA转膜90 min，5%牛血清清蛋白(BSA)封闭1.h，一抗按1∶1 000稀释后同膜一起转入抗体封闭盒内，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜4次，每次10 min。加入二抗1∶2 000，孵育1 h，洗膜4次，每次10 min，电化学发光(ECL)显色液显影，以β-actin为内参，蛋白条带灰度值用Image proplus6.0软件测定，根据TLR4/β-actin和NF-κB/β-actin条带灰度值比值进行统计学分析。

1.2.5ELISA法检测人前列腺癌PC3细胞株IL-6和TNF-α表达

每孔调整细胞数为1×105/L，接种于96孔板，处理细胞后取细胞上清液按1 000×g离心10 min，每孔加入样品稀释液40 μL，待测样品10 μL，酶标板轻轻晃动，37 ℃孵育30 min，撕掉封板膜，弃去液体，甩干，加满洗涤液，静置30 s后甩干，反复3次，每孔加入酶标液50 μL，37 ℃孵育30 min，洗涤3次，加显色液A 50 μL，显色液B 50 μL，摇匀，37 ℃避光显色，加终止液50 μL，空白调零，酶标仪450 nm波长下检测。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 Res对人前列腺癌PC3细胞株增殖的影响

Res各剂量组人前列腺癌PC3细胞株的细胞存活率为70.10%～78.35%；与阴性对照组相比，10 μmol/L及以上Res剂量组能抑制人前列腺癌PC3细胞株增殖，呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 Res对人前列腺PC3细胞株增殖影响

2.2 Res对人前列腺癌PC3细胞株细胞凋亡的影响

实验结果显示阴性对照组细胞呈浅蓝色，凋亡细胞较少；Res各剂量组可见凋亡细胞呈亮蓝色，并可见细胞核固缩、核碎裂等现象。Res各剂量组抑制Bcl-2表达，促进Bax表达，各剂量组Bcl-2/Bax比值降低，除Res 10 μmol/L组外，与阴性对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1、2，表2。

A：阴性对照组；B：TLR4阻断剂组；C：Res 40 μmol/L组；D：Res 20 μmol/L组，E：Res 10 μmol/L组。图1 Res对人前列腺癌PC3细胞株细胞凋亡的影响(Hochest33342荧光染色，×400)

图2 Res对人前列腺癌PC3细胞株细胞Bcl-2/Bax表达的影响

2.3 Res对人前列腺癌PC3细胞株细胞TLR4及NF-κB表达的影响

Res各剂量组、TLR4阻断剂组TLR4相对表达水平明显降低(P<0.05)；Res 20、40 μmol/L剂量组、TLR4阻断剂组NF-κB相对表达水平明显降低(P<0.05)；Res各剂量组与TLR4阻断剂组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3、表2。

图3 Res对人前列腺癌PC3细胞株细胞TLR4及NF-κB表达的影响

表2 Res对人前列腺癌PC3细胞株TLR4、NF-κB表达及Bcl-2/Bax的影响

2.4 Res对人前列腺癌PC3细胞株炎性因子表达的影响

与阴性对照组比较，Res各剂量组IL-6、TNF-α水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 Res对人前列腺癌PC3细胞株IL-6和TNF-α表达的影响

续表3 Res对人前列腺癌PC3细胞株IL-6和TNF-α表达的影响

3 讨 论

前列腺癌是目前男性发病率较高的肿瘤之一，尤其在北美和欧洲地区[7]。目前其治疗仍以手术、化疗等方式为主。尽管近年来不断有新的化疗药物被批准用于治疗前列腺癌，如多西他赛、卡巴西他赛，但前列腺癌仍是男性因癌症死亡的第五大原因，占男性癌症病死率的6.6%[8]；而在亚洲国家，前列腺癌1年、5年和10年存活率分别为81.0%、61.9%和36.2%[9]。

大量临床试验表明，中药在预防前列腺癌方面具有积极作用，许多从中草药提取的化合物已被证明可通过不同途径抑制前列腺癌的发生、发展，有望在未来用于前列腺癌的临床治疗[10]。Res的抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用一直是肿瘤防治的研究热点，目前已有研究证实Res对癌症的防治具有有益作用，而且不良反应少。一项为期10年的流行病学研究表明，通过食用葡萄而非葡萄酒摄入Res的女性患乳腺癌的风险降低了50%以上[11]。Res的一些Ⅰ期和Ⅱ期临床试验也正在进行中。本研究结果显示，10 μmol/L及以上浓度的Res即可抑制人前列腺癌PC3细胞株的生长，促进细胞凋亡，提示Res具有抑制人前列腺癌PC3细胞株生长，促进其凋亡的作用。

凋亡蛋白Bcl-2/Bax是反映凋亡发生、发展的经典蛋白，因此进一步分析Res对凋亡蛋白Bcl-2/Bax是否产生影响。Bcl-2具有抑制细胞凋亡，延长细胞生存期的作用。Bax则是促进细胞凋亡蛋白，具有对抗Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡的作用。Bcl-2与Bax形成二聚体的比例决定了细胞凋亡与存活的状态，即当Bcl-2/Bax比值增加，细胞存活率高，Bcl-2/Bax比值降低，细胞存活率则降低[12]。本研究结果显示，Res能抑制Bcl-2表达，促进Bax表达，降低了Bcl-2/Bax比例，提示Res促进人前列腺癌细胞凋亡的作用与此有关。

临床前研究表明，慢性炎症与前列腺癌进展有关，如在前列腺肿瘤标本和切除的组织中发现慢性炎症，其他分子、实验和临床的证据也表明慢性炎症和前列腺癌风险呈正相关[13]，提示炎症可能是前列腺癌发生的驱动因素。炎性介质被认为是参与前列腺癌发生、发展的因素，有可能成为治疗干预的靶点；而炎症相关的白细胞局部浸润、信号分子(包括细胞因子和趋化因子)产生，则与下游效应器如NF-κB、Wnt通路激活有关[14]。TLR4信号通路也是参与炎症发生、发展的重要通路，已有研究显示前列腺癌细胞中TLR2、4、9的激活可能促进肿瘤生长[15]。故本研究进一步分析Res是否通过影响TLR4通路蛋白表达，影响下游炎性因子，从而达到抑制前列腺癌细胞增殖的作用。因此，检测了TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-α的表达。结果显示，Res干预后前列腺癌细胞中TLR4蛋白表达水平明显降低，与使用TLR4抑制剂相似，同时下游NF-κB蛋白表达水平和炎性因子(IL-6、TNF-α)表达水平也明显降低，提示Res抑制肿瘤细胞生长可能与阻断TLR4，以及抑制下游NF-κB蛋白表达和炎性因子IL-6和TNF-α表达有关。

综上所述，Res能抑制人前列腺癌PC3细胞增殖，促进其凋亡，可能与抑制TLR4、NF -κB蛋白，下调Bcl-2/Bax比值，减少炎性因子IL-6和TNF-α表达有关，其是否涉及其他信号通路尚有待进一步研究。