电针不同腧穴对胰岛素抵抗肥胖大鼠肠道屏障功能及炎症状态的影响❋

周广文， 陈 丽， 王静芝， 吴永贵， 梁凤霞

(湖北中医药大学， 武汉 430065)

据世界卫生组织统计，至2016年全球有超过19亿人超重，其中6.5亿已发展成为肥胖。不仅如此，在这19亿人口中有3.4亿为青少年[1]，肥胖已成为世界范围内普遍流行的疾病。过高的体质量指数(body mass index，BMI)是心血管疾病、糖尿病、肌肉骨骼系统疾病及癌症的主要风险因素。对于肥胖儿童来说，除了承受心理压力外，还可能出现呼吸困难、骨折、高血压及胰岛素抵抗等病理状态。因此，及早干预机体超重及肥胖状态,对提高人们生活质量具有重要意义。

越来越多的证据表明，肠道微生物通过影响肠道屏障功能参与以代谢紊乱为特征的低度炎症的发病[2]。当肠道上皮屏障功能减弱，肠道微生物及其有害代谢产物可作为抗原进入上皮细胞，促使树突状细胞和巨噬细胞在提呈抗原的同时分泌肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)等促炎因子，引发全身炎症反应[3]。最近的调查结果显示，肥胖及其代谢后果，如高血压、糖尿病等均与肠道屏障功能的破坏有关。肠屏障功能障碍可导致炎症加重，而炎症又可通过破坏紧密连接蛋白而进一步破坏肠道屏障[4]。针灸能够通过多方面机制改善肥胖及胰岛素抵抗，包括调节脂肪代谢，减轻机体炎症反应及氧化应激，影响食欲调节激素及下游信号通路抑制食欲等[5]。本实验旨在研究不同部位腧穴配伍电针对胰岛素抵抗肥胖大鼠肠道屏障功能及肠道炎症状态的影响，为临床推广运用“标本配穴” 法治疗胰岛素抵抗肥胖提供实验依据。本研究通过湖北中医药大学动物伦理委员会审查，批准编号201703001。

1 材料

1.1 动物

SPF级健康雄性Wistar 大鼠60只，7周龄，体质量170～210 g，由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物合格证号SCXK(鄂)2015-0018。经检疫观察后进入湖北中医药大学SPF级动物实验室饲养，室温20～24 ℃，湿度40%～60%，光照时间12 h/d，动物自由饮水摄食。

1.2 主要试剂及仪器

闭锁连接蛋白-1 (zonula occludens-1, ZO-1，美国affbiotech，AF5145)；紧密连接蛋白(Occludin，美国Abcam，ab31721)；TNF-α(美国Abcam，ab6671)；IL-1β(北京博奥森,bs-20448 R)；HRP标记的二抗(美国ASPEN,AS1107)；荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa，RR420A)；反转录试剂盒(日本TaKaRa，RR047A)。

0.30 ×15 mm华佗牌毫针(苏州医疗用品厂有限公司)；HANS LH202 H型电针治疗仪(北京华运安特科技有限责任公司)；强生稳豪倍优型快速血糖仪(Surestep美国强生)；ADVIA2400型全自动生化分析仪(德国西门子)；TGL-16c型离心机(上海安亭科学仪器厂)，DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)；DR-200Bs型酶标仪(Diatek，中国德朗)；荧光定量PCR仪(美国Life technologies，StepOne? Real-Time PCR System)。

2 方法

2.1 动物分组及造模

所有大鼠适应性喂养1周后分为正常组(A组)8只，给予普通饲料喂养，余下52只大鼠采用高脂饲料(总热量5.4 kcal/g)喂养8周，建立胰岛素抵抗肥胖大鼠模型。将造模后体质量超出普食喂养大鼠20%者作为实验性肥胖大鼠，并从中随机选取5只行高胰岛素-正葡萄糖钳夹术[6]，以检测全身胰岛素敏感性，以葡萄糖输注速率(glucose infusion rate，GIR)判断是否存在胰岛素抵抗。以正常组大鼠的GIR平均值作为标准，若所测大鼠的GIR小于标准值20%则认定为胰岛素抵抗。选取造模成功的32只大鼠随机分为模型组(B组)、腹部电针干预组(C组)、下肢电针干预组(D组)、标本配穴电针干预组(E组)4组各8只。

2.2 干预方法

A组和B组不给予任何处理。C组选取“关元”和“中脘”，D组选取“足三里”和“丰隆”，E组选取“中脘”“关元”“足三里”“丰隆”4穴进行电针治疗。用不锈钢毫针直刺“足三里”“丰隆”穴，深度3～5 mm，每次取单侧，左右交替使用；“关元”穴向剑突方向，“中脘”穴向耻骨联合方向斜刺 3～5 mm。同侧“足三里”“丰隆”穴连接电针治疗仪的1对电极，“关元”“中脘”连接1对电极，电针参数为2 Hz，1 mA，连续波。每日电针10 min，每周治疗 3 次，共治疗8周。

2.3 取材与指标检测方法

2.3.1 体质量、血糖和GIR检测 体质量、血糖和GIR在电针干预前后分别测量，血糖采用尾部取血，快速血糖仪测定，GIR采用高胰岛素-正葡萄糖钳夹术以检测全身胰岛素敏感性，操作方法如前[6]。其中，体质量、空腹血糖和GIR在大鼠禁食12～14 h后检测，餐后血糖于大鼠进食后2～4 h检测。

2.3.2 取材 8周治疗结束后，大鼠禁食12～14 h，2%戊巴比妥钠(0.25 mL/100 g)腹腔麻醉。分离大鼠距肛门6～8 cm处的3 cm结肠组织，于预冷的0.9%氯化钠溶液中洗净内容物后吸去水分，置于冻存管中-80 ℃保存待测。

2.3.3 免疫印迹法测定ZO-1、Occludin、TNF-α、IL-1β的蛋白表达 将各组结肠组织用RIPA裂解后提取总蛋白，BCA 法测定浓度后以30～40 μg蛋白加样，SDS-PAGE分离蛋白，以300 mA恒流转膜后，用5%脱脂奶粉常温封闭PVDF膜1 h，加入一抗ZO-1(1∶500)、Occludin(1∶1 500)、TNF-α(1∶1 000)、IL-1β (1∶500)和β-actin (1：10 000)4 ℃孵育过夜，加入二抗(1:10 000)室温孵育30 min，洗膜后用ECL发光法显影。以目的条带和β-actin 条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

2.3.4 实时荧光定量PCR测定ZO-1、Occludin 、TNF-α、IL-1β的mRNA表达 各组结肠组织充分研磨后加入 Trizol提取总RNA，并检测其浓度和纯度。使用反转录试剂盒合成cDNA，使用荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR，反应程序为：预变性95 ℃，1 min；循环(40次)95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s；熔解曲线60 ℃→95 ℃，每20 s升温1 ℃。采用2-ΔΔCt法进行数据分析，引物序列见表1。

表1 引物序列表

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 不同腧穴配伍对大鼠体质量、血糖和GIR的影响

图1示，治疗前与A组比较，B、C、D和E组大鼠体质量、餐后血糖明显升高(P<0.01，P<0.05)，GIR明显降低(P<0.01)。治疗结束后，与A组比较，B组大鼠体质量、空腹血糖、餐后血糖明显升高(P<0.01)，GIR明显降低(P<0.01)；与B组比较，C、D与E组大鼠的体质量、餐后血糖明显降低(P<0.05，P<0.01)，GIR明显升高(P<0.05，P<0.01)。

注：与A组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与B组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；正常组(A组)；模型组(B组)；腹部电针干预组(C组)；下肢电针干预组(D组)；标本配穴电针干预组(E组)

3.2 不同腧穴配伍对肠道组织ZO-1、Occludin的影响

图2示，与A组比较，B组ZO-1、Occludin基因与蛋白的表达均明显降低(P<0.01)；与B组比较，C组和E组ZO-1的蛋白水平明显升高(P<0.05)，C组、D组和E组Occludin蛋白水平均明显升高(P<0.01)，E组ZO-1和Occludin的mRNA水平明显升高(P<0.05，P<0.01)；与E组比较，C组和D组的Occludin蛋白水平较低(P<0.05)。

注：与A组比较：2)P<0.01；与B组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与E组比较：5)P<0.05；正常组(A组)；模型组(B组)；腹部电针干预组(C组)；下肢电针干预组(D组)；标本配穴电针干预组(E组)

3.3 不同腧穴配伍对肠道炎症因子TNF-α和IL-1β的影响

图3示，与A组比较，B组TNF-α、IL-1β蛋白与mRNA的表达均明显升高(P<0.01，P<0.05)；与B组比较，E组大鼠TNF-α、IL-1β蛋白与mRNA水平均显著降低(P<0.01)；C组和D组TNF-α、IL-1β蛋白水平明显降低(P<0.05，P<0.01)；与E组比较，C组和D组的TNF-α、IL-1β蛋白水平升高(P<0.01)。

注：与A组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与B组比较：3)P<0.05；4)P<0.01；与E组比较：6)P<0.01；正常组(A组)；模型组(B组)；腹部电针干预组(C组)；下肢电针干预组(D组)；标本配穴电针干预组(E组)

4 讨论

当前肥胖已成为日趋严重的社会及健康问题，其不仅是单纯的体质量增加，还与代谢综合征密切相关，包括血脂异常、高胰岛素血症、高血糖、高血压病等。目前普遍认为肥胖与“脂肪-胰岛内分泌轴”抵抗有关。肥胖患者由于对瘦素及胰岛素的敏感性降低，使得“脂肪-胰岛素轴”反馈作用减弱，从而加重血脂代谢紊乱[7]。其疾病发生和进展都与胰岛素抵抗及其信号调控途径紊乱密切相关。而不少中药也证实具有改善IR的作用，如一些单味中药提取物或中药复方，黄蜀葵花总黄酮、小檗碱、黄芪多糖以及黄芪汤等[8]。目前国内外研究显示，针刺也是治疗单纯性肥胖的有效工具[9]。针刺可以通过神经-内分泌途径调节胰岛素信号通路的功能活动，进而调节胰岛素的分泌，还可以通过调节胰岛素靶器官的糖脂代谢水平与氧化应激反应，提高胰岛素抵抗患者胰岛素敏感性[10]。而针刺改善胰岛素抵抗的作用是否同调节肠道菌群微环境有关的研究较少。目前，肠道菌群已被认为是代谢疾病发展的重要因素，并被作为一种内分泌器官参与机体能量稳态和宿主免疫的调节[11]。肠道屏障是肠道菌群与宿主之间相互作用的重要桥梁，肠黏膜屏障功能发生障碍时，肠内细菌及内毒素易位是导致肥胖和胰岛素抵抗的重要因素。研究发现，糖尿病小鼠的双歧杆菌和乳酸菌减少，肠道黏膜紧密连接蛋白及 ZO-1 表达水平降低，肠道通透性增加，炎症因子 TNF-α、IL-6 等水平提高；而当研究人员选择性增加双歧杆菌、乳酸菌后，紧密连接蛋白水平恢复正常状态，炎症因子水平下降，提示肠道屏障损伤在肠道菌群紊乱介导的糖尿病发生中起重要作用[12]。此外，高脂饮食可通过减少紧密连接蛋白 ZO-1和闭合蛋白的编码基因，表达引起肠道屏障功能减弱，渗透性增加，从而促进脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)吸收入血，产生内毒素血症[13]。后者还可引起厚壁菌门比例增加，拟杆菌门比例下降，从而加剧肠道菌群失调。LPS 结合蛋白和 CD14+单核细胞与LPS 结合并将其呈递给 toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化受体2 (myeloid differentiation receptor 2,MD2)受体复合体，诱导宿主产生免疫应答相关蛋白，产生 IL-1β、TNF-α和 IL-6，发生低度炎症反应，加剧肥胖和胰岛素抵抗的进程[14]。这些研究结果表明，肠道屏障功能的破坏及肠道慢性炎症的发生是肠道微生物群诱发胰岛素抵抗发病的关键因素。因此，抑制肠道炎症、减轻肠屏障功能障碍是改善胰岛素抵抗肥胖的潜在途径。

研究表明，不同部位的腧穴针刺对肠道的作用各不相同，如下肢穴位和腹部穴位均广泛作用于调节胃肠运动障碍[15]。而从部位上划分，本次研究选取的中脘、关元位于腹部，足三里、丰隆位于下肢部。腹部为脂肪最容易堆积处，同时也是脾经、胃经、肾经、任脉等多经的循行所过之处。刺激腹部可以最大程度上疏通经脉，消浊降脂[16]。根据腧穴的近治作用，在治疗时选取腹部穴位治疗，体现了“腧穴所在，主治所在”。研究表明，腹部电针对减轻内脏超敏症状和保护胃肠道有积极作用[17],而艾灸腹部募穴能够选择性调节肠道益生菌群，如温和灸“关元”穴能够使双歧杆菌、乳酸杆菌数量显著增加，温和灸“天枢”穴能够使大肠杆菌、肠球菌数量显著增加，进而调节肠道菌群失调[18]。而本次研究也证实，腹部电针能够减轻肥胖大鼠的体质量、降低血糖、提高GIR，并能提高肥胖大鼠肠道Occludin、ZO-1蛋白与mRNA的含量，明显降低TNF-α、IL-1β蛋白水平。而根据腧穴的远治作用，治疗选取脾胃经经脉所过之处的下肢腧穴为主(特定穴多分布于膝关节以下)，体现“经脉所过，主治所及”[19]。如研究显示，电针“足三里”可能通过AMP 依赖的蛋白激酶(amp-activated protein kinase,AMPK)/Unc-51样激酶1(unc-51-like kinase1,ULK1)信号，抑制功能性消化不良大鼠过度自噬而促进胃肠运动[20]。课题组前期与本次研究均表明，电针“足三里”“丰隆”穴能够降糖，增加胰岛素敏感性的作用与抑制炎性因子表达，改善肠黏膜屏障作用有关[6]。前期研究还发现，针刺腹部、下肢部穴位均可改善大鼠的肥胖状态,其机制可能与调控瘦素(leptin，LEP)、胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)的表达,从而延迟胃排空,加快小肠推进率,减少进食量有关[21]。已有临床研究表明，在降低单纯性肥胖患者体质量及改善血脂方面，基于“标本配穴”理论的针灸疗法取得了与西医减肥药同等的疗效。在改善胰岛素抵抗方面，针灸疗法显著胜于西药疗法，且“标本配穴”针灸疗法为无不良反应的绿色疗法[22]。而本次研究结果也表明，与单纯的腹部取穴或下肢取穴组比较，将腹部和下肢部穴位联用的标本配穴组，能更为显著地降低肥胖大鼠的体质量，增强肠道Occludin、ZO-1表达，降低肠道内IL-1β和TNF-α的表达。

综上所述，标本配穴针刺能够通过下调肠道炎症因子IL-1β和TNF-α的表达，抑制炎症反应，同时增强肠道紧密连接关键蛋白Occludin和ZO-1的表达，恢复其肠道屏障功能，从而维持肠道稳态，改善胰岛素抵抗肥胖。