基于UPLC-MS的肝癌脾虚湿盛证患者血浆代谢组学研究❋

李晶洁， 刘述梅， 王 东， 刘 江， 吕书勤

(新疆维吾尔自治区中医医院， 乌鲁木齐 830000)

原发性肝癌是威胁生命的恶性肿瘤，中国的原发性肝癌患者数量位居全球第一，约占全世界总数量的50%[1]。原发性肝癌分为肝细胞癌和肝内胆管细胞癌，其中肝细胞癌发生率约70%～90%，肝内胆管细胞癌约15%[2]。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是用于诊断原发性肝癌的主要标志物。但在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染的慢性肝炎和肝硬化患者中，AFP含量也偏高[3]，严重干扰着诊断的准确性，因此有必要筛选更具特异性的肝癌诊断标志物。代谢组学(metabonomics)是以一个生命体系统中特定生理或病理条件下所有代谢组分的定性定量分析为核心的学科[4，5]。主要研究目的是揭示某种生理或病理状态在代谢水平的规律。代谢组学应用的技术包括核磁共振氢谱(1 h-nuclear magnetic resonance，1 H-NMR)、气相色谱(gas chromatography，GC)、液相色谱(liquid chromatography，LC)和质谱分析(mass spectrum，MS)等。应用代谢组学技术可对原发性肝癌进行代谢水平的模式识别，寻找潜在的代谢标志物，丰富代谢组学在肝癌研究中的应用。

中医理论中，“证候”是了解和诊治疾病的基础。肝癌以脾虚为本，气滞、血瘀、湿邪为标[6]。中医临床发现，肝癌的单证证候包括气滞、血瘀、脾气虚、肾阴虚和肝胆湿热等[7]。单证证候通常组合为复杂证候出现。研究发现约有40%的肿瘤患者存在脾虚湿盛的症状[8]。本文使用超高效液相色谱-质谱联用(ultra performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry，UPLC-MS)方法检测肝癌脾虚湿盛证患者的血浆代谢组分，并与健康人血浆代谢组分比较，通过建立偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriiminate analysis，PLS-DA)模型鉴别差异代谢物，以期从代谢水平研究肝癌脾虚湿盛证的证候本质。该研究已获得新疆医科大学附属中医医院专家委员会批准,伦理审查批件号2014XE0113。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本研究招募新疆医科大学附属中医医院的肝癌脾虚湿盛证患者16例作为患者组，全部患者均被诊断为原发性肝癌且为第一诊断。根据随机原则，新疆医科大学附属中医医院体检中心招募21名健康志愿者作为健康组。随机招募的肝癌脾虚湿盛证患者中，年龄最大者83岁，最小者35岁；正常对照组中年龄最大者80岁，最小者24岁，组间年龄、性别比较差异无统计学意义(P<0.05)。2组样本基础信息见表1。

1.2 诊断标准

西医诊断标准参照第八届全国肝癌学术会议上通过的《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》[9]，中医脾虚湿盛证参照国家中医药管理局发布的《中医证候辨治轨范》[10]及《中医病证诊断疗效标准》[11]中的标准。

1.3 纳入标准

符合原发性肝癌西医诊断标准及中医证候诊断标准；由至少两位以上主治医师进行中医辨证分型；所有病例均自愿并签署知情同意书。

1.4 排除标准

转移性肝癌、良性肝脏肿瘤或原发合并其他恶性肿瘤；伴有严重心、脑、肾及造血系统等并发症；合并活动性结核及严重的感染性疾病；临床资料不全或不能合作者；年龄在18岁以下；妊娠期或哺乳期妇女。

1.5 样本采集

所有研究对象于清晨采集空腹前臂静脉血2 mL，肝素抗凝，静置后以5440×g离心10 min，取上层血清于EP管中标记姓名及编号，保存于-80 ℃超低温冰箱。

1.6 主要仪器

超低温冰箱(中国海尔公司，DW-86L578ST)；质谱仪(德国ThermoFisher公司，Q Exactive)；色谱仪(德国ThermoFisher公司，Accela)；色谱柱(德国ThermoFisher公司，ScientificTMProPacTMSCX-10)等。

1.7 样本处理

将血清样本从-80 ℃冰箱取出，4 ℃解冻，取100 μL置于 EP管中，加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，涡旋震荡、冰浴静置5 min，25000×g 4 ℃离心10 min，取一定量的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为60%，并置于带有0.22 μm滤膜的离心管中，以15000×g 4 ℃离心10 min，收集滤液进行UPLC-MS检测。

色谱条件：柱温40 ℃，流速0.2 mL/min，正模式下，流动相A为0.1%甲酸，流动相B为甲醇；负模式下，流动相A为5 mmol/L醋酸铵，pH9.0，流动相B为甲醇。

质谱条件：扫描范围选择m/z 100-1500；ESI 源设置：Spray Voltage：3.2kV；Sheath gas flow rate：35 arb；Aux Gas flow rate：10 arb；Capillary Temp：320 ℃。二级扫描为data-dependent scans。

1.8 代谢物鉴定与定量

将色谱-质谱检测的下机数据导入到Compound Discoverer(CD)软件，首先进行保留时间、荷质比等参数筛选，然后对不同样本根据保留时间偏差0.1 min 和质量偏差5 ppm进行峰对齐，再根据设置的质量偏差 5 ppm、信号强度偏差30%、信噪比3、最小信号强度100000、加和离子等信息提取信号峰，同时根据峰面积进行定量，通过分子离子峰和碎片离子预测分子式，并与mzCloud 和Chemspider数据库进行比对，利用空白样本数据去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到代谢物鉴定与定量结果。

1.9 多元数据分析

使用主成分分析法(Principal Component Analysis，PCA)将鉴定的代谢物组合为不同的变量以展示总体代谢组分差异。使用metaX软件，建立PLS-DA模型。随后用Y-乱序统计验证法对PLS-DA模型进行评估。通过200次随机洗牌，计算模型拟合度(R2)和预测能力(Q2)参数。理论中，Q2值应小于R2即表明模型未被过拟合。

1.10 差异代谢物筛选

首先利用建立的PLS-DA模型计算代谢物的变量重要性投影(variable importance in projection，VIP)值。代谢物的VIP值越大，表明其在模型中越关键。然后应用t检验计算代谢物的统计学差异(P值)。最后，VIP值>1、P<0.05、差异倍数(fold change，FC)>2或FC≤0.5的代谢物被认为是差异代谢物。根据log2(FC)和-log10(P值)绘制火山图，展示差异代谢物。

1.11 层次聚类与KEGG富集分析

首先使用标准分数(z-score)将代谢组学数据进行标准化，然后利用R语言中的pheatmap包绘制层次聚类热图。随后使用京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)数据库进行差异代谢物的代谢通路富集分析。当富集通路的P值<0.05时，被认为是具有统计学意义的富集。

2 结果

2.1 肝癌脾虚湿盛证代谢组分特征

在正模式和负模式的UPLC-MS检测中发现，肝癌脾虚湿盛证患者与健康体检者血浆中有很多相同的内源性代谢产物。图1展示了患者组与健康组代谢谱中主成分的二维和三维的空间分布，可以看出2组样本代谢轮廓并不完全重叠。而从代谢谱的空间分布来看，健康人的代谢谱相比于肝癌脾虚湿盛证患者表现出更好的组内团聚性。

注：A.负模式下第一主成分和第二主成分的二维投影；B.负模式下PCA的三维投影；C.正模式下，第一主成分和第二主成分的二维投影；D.正模式下PCA的三维投影

图2A和2B示，根据代谢物定性定量结果构建PLS-DA模型，模型中每个样本在正负模式下的第一、第二主成分在二维空间中的投影。2个组群被明显分离，且每组中大部分样本都处于95%置信区间内。图2C和2D示，对PLS-DA模型的排序检验结果在正模式和负模式下，Q2值均小于R2值说明PLS-DA判别模型的有效性。

注：A.负模式下PLS-DA模型第一主成分和第二主成分的二维投影；B.正模式下PLS-DA模型第一主成分和第二主成分的二维投影；C.负模式PLS-DA模型过拟合验证；D.正模式PLS-DA模型过拟合验证

2.2 差异代谢物筛选结果

图3示，根据VIP值>1、P值<0.05、差异倍数(FC)>2或FC≤0.5的标准筛选肝癌脾虚湿盛证患者代谢谱中的差异代谢物。图3A为负模式下的代谢谱，共鉴定出2242种代谢物，差异代谢物有293种，其中95种显著上调，198种显著下调；图3B是正模式下的代谢谱，共鉴定出1430种代谢物，差异代谢物有167种，其中70种显著上调，97种显著下调。

注：A.负模式下筛选的差异代谢物；B.正模式下筛选的差异代谢物

表2示，肝癌脾虚湿盛证患者组血浆中呋喃酮、琥珀酸、葡萄糖苷、β-D-吡喃半乳糖苷、5-羟色胺、植酸萘二酚、柠檬酸和甘油三酯的代谢水平显著低于健康对照组；而皂皮酸、甘氨酸、环丝氨酸、甘油酸、乙酸丁酯、罗沙替丁、丹酚酸、吡喃糖醛酸、丙二酸和胆酸的代谢水平却显著高于健康对照组。

表2 肝癌脾虚湿盛证患者血浆中部分差异代谢物比较

2.3 层次聚类与KEGG富集结果

将代谢物相对定量值经过z-score转换后，对样本间代谢物的代谢模式进行层次聚类分析。图4示，相似代谢模式的样本会聚为一簇，可以看出正负模式下肝癌患者组的代谢模式与健康对照组均有明显不同。

图4示，差异代谢物在KEGG数据库中所富集的代谢通路。表3示，根据P值排序，负模式下最显著富集的通路是“Drug metabolism-cytochrome P450”，正模式下最显著富集的通路是“Taurine and hypotaurine metabolism”。在肝癌脾虚湿盛证的血浆中，差异代谢物显著富集的生化代谢途径和信号传导通路共6个。

表3 肝癌脾虚湿盛证血浆中差异代谢物富集通路结果比较

注：A.负模式下代谢物聚类热图；B.正模式下代谢物聚类热图；C.负模式差异代谢物富集通路；D.正模式差异代谢物富集通路

3 讨论

肝癌的发病及临床表现与湿邪的性质与特点相似。在肝癌早期常无任何症状和体征，迨至湿邪已重却又变证多端。肝癌中晚期患者常有肝区疼痛、食欲减退、乏力、消瘦、黄疸、腹水等多种临床表现，舌苔也以腻苔多见[12]。由此可见，其发病过程均与湿邪密切相关。湿邪伤脾，运化无权，水谷精微不得消化吸收,气血生化不足，肢体失于濡养，可见胃纳减退，神疲乏力，形体消瘦，腹胀便溏；脾虚不能运化水湿，湿痰内聚，阻滞气机，升降失常，可见腹满便闭、胸胁作痛、恶心呕吐；脾失健运，湿壅中焦，滞而化热，延及肺肾，水液滞留则面浮肢肿、腹胀如鼓且尿少。脾虚生湿，湿阻气滞，气滞则血运无力可致血瘀，气滞血瘀，脉络不和，积而成块，故胁痛拒按，固着不移。积块日久，血络瘀结，中气大伤，运化无权，故疼痛加剧，饮食大减，消瘦脱形。湿毒是肝癌发病的重要致病因素，湿毒内蕴是肝细胞癌变的病理基础，痰瘀蕴结是肝脏癌变的基本病理变化。

使用多元分析策略对肝癌脾虚湿盛证代谢谱数据进行了鉴定和差异代谢物筛选。在总体PCA分析结果中，健康对照组样本比患者组样本表现出更强的团聚性，说明肝癌脾虚湿盛证患者的血浆代谢组分发生异常，代谢功能紊乱程度加重。PLS-DA模型显示，患者组和对照组的样本明显分离，随后根据PLS-DA模型计算VIP值以表示各代谢物对肝癌脾虚湿盛证的贡献程度。最后筛选出负模式下293种差异代谢物，正模式下167种差异代谢物。

在差异代谢物中发现，肝癌脾虚湿盛证患者的糖代谢、胆汁酸代谢和氨基酸代谢发生了不同程度的异常。患者血浆中柠檬酸和琥珀酸水平均明显低于正常人。柠檬酸和琥珀酸都是三羧酸循环的重要中间产物，而三羧酸循环是糖、脂质、蛋白质代谢的共同代谢途径[13]，表明肝癌脾虚湿盛证患者的三羧酸循环机制受到严重影响。肝脏是合成糖代谢途径中多种关键酶的主要场所，柠檬酸和琥珀酸水平的下调预示肝癌细胞调控糖代谢能力有所减弱[14]，同时还发现，肝癌脾虚湿盛证患者血浆中的胆酸水平显著升高。胆酸是胆固醇代谢过程中的中间物，可作为前体合成胆汁中的多种胆汁酸[15]。生理过程中，胆汁酸可促进肠-肝系统对胆固醇和脂质的吸收[16]。而胆酸在血液中水平升高说明胆汁酸的合成途径受阻，因此胆酸可作为肝癌脾虚湿盛证的候选生物标志物。此外，患者组血浆中甘氨酸、环丝氨酸等氨基酸含量高于对照组，说明肝癌脾虚湿盛证使多肽合成受到影响。脾虚时运化失权，腐熟功能失职，患者胃肠功能减退，如食欲差、摄入量少、吸收不良，导致机体不能从食物中摄取足量的必需氨基酸，而出现血浆里多种氨基酸含量降低。肝细胞受损时消耗谷胱甘肽会导致甘氨酸被大量转化[17]。陆伟[18]等报道，肝癌细胞的体外培养也会发生氨基酸水平异常，因此肝癌细胞很可能与肝细胞受损有类似的氨基酸代谢表征。同时KEGG富集分析显示，多个通路与肝癌脾虚湿盛证存在关联。Drug metabolism-cytochrome P450是细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)药物代谢相关通路。临床通常采用联合用药治疗肝癌，肝损伤出现频率甚高[19]。CYP450是药物体内代谢的主要酶，是发生药源性肝损伤的关键因素[20]。因此，在治疗肝癌患者时，或可考虑选择能够抑制CYP450活性的药物，尽量避免肝损伤。

本研究通过与健康人群的代谢谱进行比较，确定了脾虚湿盛证肝癌的代谢表征，一定程度上反映了脾虚湿盛证肝癌的病理生理变化，这种认识疾病的方法既有现代医学认识疾病的特点，又结合了中医辨证的特征，对于探索中医“同病异证”具有很大的优势。本研究利用代谢组学技术丰富了中医证候理论的生物学基础，同时为寻找精准诊断肝癌脾虚湿盛证的潜在生物标志物提供了可能。随着代谢组学技术的日益成熟和研究的不断深入，以及与各种组学技术的成功对接，相信将在原发性肝癌早期诊断、治疗、预后的研究中发挥更大的作用，最终将广泛应用于临床，造福于患者。