逍遥散对慢性束缚应激肝郁脾虚证大鼠MMP2、TIMP2表达的影响❋

秦生发， 张 铮， 蓝敏敏， 李熠毅， 常晓威， 韦俊彬， 李晓红,2△， 杨力强,2△

(1.广西中医药大学， 南宁 530200；2.广西中医药大学广西中医基础研究重点实验室， 南宁 530200)

肝郁脾虚证是指肝失疏泄，脾失健运，以胸胁胀痛、腹胀、便溏、情志抑郁症状为主要表现的证候，在临床涉及诸多疾病，是情志相关疾病的主要临床证型之一[1]，应激事件能诱发肝郁脾虚证或加重肝郁脾虚证患者的临床表现。研究表明，肝郁脾虚病理机制与脑-肠轴学说和脑肠互动理论异曲同工[2]。逍遥散出自《太平惠民和剂局方》，由柴胡、白术、白芍、当归、茯苓、甘草、薄荷、烧生姜8 味药物组成，对防治应激性疾病及肝郁脾虚证具有良好的疗效[3-4]。课题组长期的研究表明，慢性应激肝郁脾虚证大鼠存在脑肠轴功能紊乱与脑肠互动功能障碍[5-8]，具有下丘脑、胃组织差异表达基因组学背景[9-10]；而逍遥散能够拮抗慢性应激肝郁脾虚证大鼠HPA轴功能亢进，缓解大鼠的抑郁表现[11]，通过双向调节脑肠轴上多种神经肽的异常表达，从而改善肝郁脾虚证大鼠的脑肠互动功能障碍[5-8]，参与神经-内分泌-免疫网络的整合功能，发挥其抗应激作用[12]。课题组前期在慢性束缚应激诱导的肝郁脾虚证大鼠下丘脑、胃、结肠组织的基因表达谱实验中发现，肝郁脾虚证大鼠体内众多与肿瘤相关的基因发生了变化，在后续的研究中选择与肿瘤发生发展密切相关的基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)、基质金属蛋白酶组织抑制剂2(matrix metalloproteinase tissue inhibitor 2，TIMP2)2个指标，检测其在血清中的含量以及胃组织中基因和蛋白表达变化，并观察了逍遥散的调节作用，现报道如下。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠75只，6～7周龄，体质量(200±20)g，由广西医科大学动物实验中心提供，动物许可证号SCXK(桂)2009-0002，动物伦理审查编号DW20190111-009。动物饲养于广西中医药大学动物实验中心普通级动物房，光照节律 12 L∶12 D，喂饲常规饲料及饮用水，室温20～22 ℃，相对湿度为50%～60%。

1.2 药物与试剂

逍遥散组成：柴胡、当归、白芍、白术、茯苓各30 g，炙甘草15 g，烧生姜10 g，薄荷(后下)10 g，制成浓度1.67 g/mL的溶液。中药饮片购自广西中医药大学附属瑞康医院，经广西中医药大学药学院滕建北教授鉴定药品质量合格。Rat MMP2、TIMP2 ELISA试剂盒(基因美公司，货号分别为JYM0522Ra、JYM0505Ra)；MMP2原位杂交试剂盒(武汉博士德生物有限公司，货号00464041-124080ETC)；逆转录试剂盒(TAKARA公司，货号639505)；YBR Green PCR 试剂盒(KAPA Biosystems公司，货号KM4101)；MMP2、TIMP2抗体(Bioswamp公司，货号分别为PAB30618、PAB32556)，GAPDH 抗体(Bioswamp公司，货号PAB36269)。

1.3 仪器

GE48527型PCR仪(杭州柏恒科技有限公司)；CFX-Connect 96型荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)；DNM-9602型酶标仪(北京普朗新技术有限公司)；mini protean 3 cell型电泳仪(美国Bio-Rad)；Tanon-5200型全自动化学发光分析仪(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 动物分组、造模与给药

75只雄性SD大鼠适应性饲养5 d后，采用随机数字表法分为正常组、7 d模型组、7 d逍遥散组、21 d模型组、21 d逍遥散组每组各15只。采用慢性束缚应激结合孤养方法造模[5,11]，除正常组以外的各组大鼠均用束缚架进行捆绑束缚，每日于18∶00～6∶00点束缚3 h，束缚时间点随机，7 d模型组和7 d逍遥散组捆绑束缚7 d，21 d模型组和21 d逍遥散组捆绑束缚21 d；从造模第 1天开始，每日在捆绑前30 min给各组大鼠灌胃，逍遥散组大鼠灌服逍遥散中药煎液，根据成人逍遥散每日用量，按体表面积换算成大鼠用药量为16.7 g/(kg·d)，灌胃容积为 1 mL/100 g 体质量，每日1次，连续7 d和21 d；正常组、模型组大鼠每日灌服同等换算量的生理盐水，造模期间根据大鼠体质量调整给药量。

2.2 取材

造模7 d和21 d结束后，各组大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射进行深度麻醉(0.4 mL/100 g 体质量)；剖开大鼠腹腔，腹主动脉取血，分离血清至1.5 mL离心管中；取血后切取全胃，用预冷的0.9%氯化钠溶液彻底冲洗干净，取胃体中部上1/3约0.3 cm×0.5 cm的胃组织，置冻存管中迅速放入液氮速冻，取材完毕将标本放入-80 ℃冰箱保存，用于荧光定量 PCR和Western blot实验；用于原位杂交实验的胃组织取胃体中部上 1/3 约 1 cm×1 cm的小块组织放入 4%多聚甲醛固定液中4 ℃固定。固定后取出胃组织标本进行洗涤、脱水、 透明、浸蜡，石蜡包埋。

2.3 指标检测

2.3.1 ELISA检测血清MMP2、TIMP2含量 采用ELISA法检测血清MMP2、TIMP2含量，严格按照试剂盒说明书操作。

2.3.2 实时荧光定量PCR检测胃组织 MMP2、TIMP2基因表达 使用Trizol 法从胃组织中提取总RNA，微量核酸蛋白分析仪检测RNA浓度、纯度及完整性；将 RNA反转录合成cDNA；PCR扩增采用20μL反应体系：SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板加样1 μL，加水至总体积为20 μL。反应程序按试剂盒说明书进行。PCR引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，GAPDH(F：5’-CAAGTTCAACGGCACAG-3’，R：5’-CCAGTAGACTCCACGACAT-3’，产物长度138bp)，MMP2(F：5’-TGGAAGCATCAAATCGGAC TG-3’，R：5’-GGAGGGCTGCATTGTGAATATC-3’，产物长度290bp)，TIMP2(F：5’-GGCGGAAGGA GATGGCAAGATG-3’，R：5’-AGTCCATCCAGAGG CACTCATCC-3’，产物长度185bp)。采用2-△△Ct来计算MMP2、TIMP2 mRNA的相对表达量。

2.3.3 Western Blot法检测胃组织MMP2、TIMP2蛋白表达 将大鼠胃组织剪碎，每20 mg组织加入250 μL裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂)匀浆至完全裂解，在4 ℃、12000×g离心15 min取上清，BCA蛋白浓度测定试剂盒蛋白定量后贮存于- 80 ℃冰箱。根据目的蛋白的分子量大小配制6%的分离胶和5%的浓缩胶，取含有20 μg 总蛋白的组织裂解产物进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后转印至PVDF膜上，将膜放入5%的脱脂奶粉中室温封闭2 h，孵育一抗，MMP2的稀释度均为 1∶2000,TIMP2、GAPDH的稀释度为1∶1000，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入辣根酶标记的二抗(1:10000)，室温孵育1 h，用PBST洗涤3次。最后通过Tanon-5200成像系统进行ECL化学发光检测，TANON GIS 软件读取各条带灰度值。以 GAPDH 为内参，检测目的蛋白MMP2、TIMP2的蛋白表达情况。

2.3.4 原位杂交检测胃组织MMP2 mRNA表达 实验步骤按照试剂盒说明书操作，具体检测步骤：切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后，用3% H202灭活内源性过氧化物酶；滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶以暴露mRNA核酸片段；滴加不含探针的预杂交液，42 ℃预杂交2 h；滴加含探针的杂交液，42 ℃杂交过夜(用PBS代替探针杂交液作为阴性对照)；滴加血清封闭液；滴加SABC进行孵育后，再滴加生物素化过氧化酶进行孵育，并用DAB显色、苏木素复染；脱水透明、封片、观察，应用Image-proPlus 6.0图像分析系统进行图像分析，每组测试9张切片，分析每张切片的阳性面积和积分光密度(intergral optical density，IOD)，以IOD表示mRNA的相对含量。MMP2探针序列：5’-TTCTA TGGCT GCCCC AAGGA GAGCT GCAAC-3’；5’-GACAG CCCTG CAAGT TTCCA TTCCG CTTCC-3’；5’-GAACC AAAGT CTGAA GTGCG TGAAG TTTGG-3’。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠血清MMP2、TIMP2含量结果

表1示，与正常组比较，7 d、21 d模型组大鼠MMP2含量均显著升高(P<0.01)，TIMP2含量均显著降低(P<0.05，P<0.01)，其中7 d模型组大鼠MMP2升高更明显，TIMP2降低更明显；逍遥散能明显降低模型大鼠MMP2含量，升高TIMP2含量(P<0.05)。

表1 各组大鼠血清MMP2、TIMP2含量比较

3.2 各组大鼠胃组织实时荧光定量 PCR检测MMP2、TIMP2mRNA表达结果

表2示，与正常组比较，7 d和21 d模型组大鼠胃组织MMP2 mRNA表达显著升高(P<0.01)，TIMP2 mRNA表达显著降低(P<0.01)，逍遥散可明显下调胃组织MMP2mRNA表达(P<0.01)，上调TIMP2 mRNA表达(P<0.01)。

表2 各组大鼠胃组织MMP2、TIMP2 mRNA表达比较

3.3 各组大鼠胃组织Westernblot检测MMP2、TIMP2蛋白表达结果

图1表3示，模型组胃组织MMP2和TIMP2的蛋白表达趋势不同，MMP2表达明显升高，TIMP2表达明显降低，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；逍遥散能降低MMP2表达，升高TIMP2表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

注：a正常组; b. 7 d模型组; c. 7 d逍遥散组; d. 21 d模型组; e.21 d逍遥散组；基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)，基质金属蛋白酶组织抑制剂2(matrix metalloproteinase tissue inhibitor 2，TIMP2)

表3 各组大鼠胃组织MMP2、TIMP2 蛋白表达比较

3.4 各组大鼠胃组织原位杂交检测MMP2 mRNA表达结果

图2表4示，MMP2杂交阳性反应物在细胞胞浆着色呈棕黄色，与正常组比较，7 d和21 d模型组大鼠胃组织MMP2 mRNA表达的阳性面积和积分光密度均显著增加(P<0.01)，说明逍遥散能逆转MMP2的异常表达(P<0.05，P<0.01)。

表4 各组大鼠胃组织MMP2 mRNA表达阳性面积和IOD值比较

注：基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)

4 讨论

应激是机体受到各种内外环境因素刺激时所出现的非特异性全身反应。以往的研究论证，由慢性束缚应激诱导的21 d大鼠模型为肝郁脾虚证大鼠模型，慢性束缚应激7 d大鼠处于急性应激期，束缚时反抗、嘶叫，这一阶段符合“肝郁证”表现；7 d后逐步适应，反抗、嘶叫逐渐减少，由急性应激期向慢性应激期转化；14 d后进入慢性应激期，应激大鼠神态倦怠、烦躁、大便稀软等症状逐渐加重，肝郁日久，木郁乘土，形成“肝郁脾虚证”表现[13]。以往的研究也表明，长期的慢性应激可以诱发和调控肿瘤的发生发展[14]。

肿瘤是由肿瘤细胞、多种基质细胞以及细胞外基质构成的有机体。肿瘤细胞的发生与转移依赖于周围的微环境，“肿瘤微环境”主要由细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、成纤维细胞、血管/淋巴管和免疫细胞组成，它们与肿瘤细胞相互作用，共同促进肿瘤的生长与转移。以往研究表明，肿瘤的发生、发展、侵袭和转移常常伴有ECM的变化及肿瘤血管的形成，最终形成适合肿瘤细胞生存的微环境。ECM由基底膜(basement membrane，BM)和细胞间质组成，为肿瘤转移的重要组织屏障。肿瘤血管是肿瘤生长和转移的形态学基础，恶性肿瘤的生长、浸润和转移依赖于新生血管的生成，新生血管的数目与临床预后有一定的关系。ECM降解是肿瘤新生血管生成、肿瘤细胞侵袭和转移的必要条件，BM的完整与否是肿瘤组织新生血管生成过程中的关键因素。因此，肿瘤细胞自身或刺激宿主细胞分泌多种蛋白水解酶影响BM和ECM的降解，在肿瘤浸润和转移的过程中是重要环节。而在此环节中，基质金属蛋白酶(MMPs)及基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMPs)的动态平衡起到关键作用。

MMPs 是一类由多种细胞分泌并能够裂解大分子细胞外基质的肽链内切酶,在肿瘤的发生、浸润与转移中起重要作用。TIMPs是一组能特异性抑制MMPs活性的多功能生物因子，可负性调节基底膜降解过程，在ECM的重塑过程中起决定作用。目前为止，已经发现的MMPs 家族成员至少有26种，TIMPs家族成员有TIMP1～4种。MMP2是MMPs的重要成员，MMP2的催化域中含有胶原结合区域，能特异性地降解BM和ECM的主要成分Ⅳ型胶原。因此，MMP2的作用与基质重建密切相关，如分解细胞外基质蛋白和细胞表面的分裂受体，特别是与癌细胞增殖有关的受体，影响肿瘤细胞的微环境。MMP2通过整合素参与血管生成，侵犯淋巴管及小血管，从而促进肿瘤的发生、侵袭与转移。以往的研究表明，MMP2过度表达与人类包括胃癌在内的多种恶性肿瘤的发生、侵袭、转移及预后密切相关[15，16]。TIMP2是TIMPs家族成员之一，是MMP2的内源性抑制剂，可优先与活化或非活化的MMP2结合，构成1∶1的复合物，发挥抑制MMP2的生理作用，参与组织损伤后修复和组织器官发育等过程[17]。TIMP2能够特异性抑制MMP2的活性，从而减少ECM的降解，降低癌细胞的迁移能力[18]。正常情况下，TIMP2与MMP2 形成动态平衡，在调节ECM的稳态中有重要作用，二者间失衡可导致ECM降解，进而促进肿瘤血管的生成。Li等[19]的研究发现，TIMP2能明显地抑制肺癌、结肠癌小鼠肿瘤的生成、血管生长和转移，延长小鼠的存活期。

本次实验结果显示，大鼠应激7 d和21 d后血清MMP2含量、胃组织MMP2 mRNA和蛋白表达均显著升高，TIMP2 的表达则显著降低，逍遥散能显著降低MMP2的表达，升高TIMP2的表达，表明7 d和21 d应激大鼠体内和胃组织出现了MMP2、TIMP2二者的平衡失调。而逍遥散可逆转MMP2、TIMP2的异常表达，恢复二者的平衡，提示由慢性束缚应激诱导的肝郁脾虚证大鼠体内可能存在易罹患胃癌的风险，逍遥散可通过调节MMP2、TIMP2的异常表达，从而降低应激大鼠患癌的风险。以往的研究也表明，慢性应激可导致MMP2的表达异常[20]，慢性应激大鼠血清CEA、CA19-9、CA724、AFP等肿瘤标志物升高，逍遥散能够有效降低慢性应激诱发的肿瘤标志物升高，有望预防慢性应激诱发的癌变[21]。临床研究亦表明，逍遥散对肿瘤患者具有良好的治疗作用[22]。

综上所述，本研究检测了MMP2、TIMP2在慢性束缚应激肝郁脾虚证大鼠血清中的含量及胃组织中的基因和蛋白表达变化，只是初步探索了胃癌发病风险，存在的不足之处是并未检测应激大鼠体内肿瘤标志物的变化情况。在今后的研究中将对前期实验进行补充完善，并进一步探索与肿瘤发生密切相关的病理机制，观察慢性应激是否可以直接刺激肿瘤的发生。