去甲斑蝥素诱导超氧阴离子的产生介导HeLa细胞线粒体途径的细胞凋亡

董 秀，包 红，韩兆丰

（1.辽宁中医药大学中西医结合学院，沈阳 110847；2.辽宁中医药大学信息工程学院，沈阳 110847）

宫颈癌是危害女性健康的常见恶性肿瘤之一[1]。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是传统中药斑蝥的有效成分斑蝥素的低毒、高效衍生物，在临床上已被用于辅助治疗肝癌和食管癌等多种癌症[2-3]。课题组前期研究发现去甲斑蝥素作用于人宫颈癌HeLa细胞后，激活内源性线粒体途径诱导HeLa 细胞凋亡和G2/M 期细胞周期阻滞[4]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是氧化磷酸化的副产品，包括超氧阴离子（O2·-）、羟自由基（·OH）和某些非ROS 等[5]。细胞内生理水平的ROS 参与细胞信号转导和调节生理进程，而过度产生的ROS 会引起细胞内生物大分子的损伤，造成氧化应激诱导细胞凋亡[6-7]。ROS 在药物诱导肿瘤细胞凋亡过程中承担重要作用，并且与线粒体途径的细胞凋亡关系密切[8-9]。课题组前期研究发现，去甲斑蝥素作用于HeLa 细胞后，诱导主要以超氧阴离子形式存在的ROS 产生，并介导HeLa 细胞凋亡。本研究考察了去甲斑蝥素诱导超氧阴离子对人宫颈癌HeLa 细胞凋亡的作用及其机制。

1 材实验料

CO2培养箱（美国Thermo 公司），荧光显微镜（德国 Leica Bensheim 公司），电泳槽（美国Bio-Rad 公司）。去甲斑蝥素购于美国Sigma Chemical公司（货号：N8784），DMSO 溶解后，无菌条件下，用RPMI-1640培养液稀释至所需浓度（DMSO ≤1‰）。人宫颈癌HeLa细胞（美国American Type Culture Collection（ATCC）公司），RPMI-1640 培养基购于美国Hyclone 公司，SOD（超氧化物歧化酶，超氧阴离子清除剂）购于（美国Sigma Chemical 公司），胎牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所，ECL试剂盒购于美国Thermo公司，抗Bcl-2，Bax，β-actin 的一抗和羊抗鼠、羊抗兔二抗均购于美国Santa Cruz 公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养 HeLa 细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640 细胞培养液中，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养。

2.2 PI 染色法检测subG1 凋亡峰 将对数生长期的HeLa 细胞，按照每瓶1×106个细胞进行分瓶，培养箱中继续培养24 h 后，加入 60 μmol/L 去甲斑蝥素作用细胞24 h 或用5 mmol/L SOD 预处理细胞1 h 后，再加入60 μmol/L 去甲斑蝥素作用24 h 后，加入胰酶消化后收集细胞，应用PBS 淋洗细胞2 次后，加入冰冷乙醇在4 ℃冰箱固定过夜。次日离心10 min 后弃去固定液，应用PBS 淋洗细胞2 次，加入含有PBS、PI 和RNA 酶的染色液1 mL，4 ℃冰箱避光冰浴1 h 后，流式细胞仪下进行分析，DNA 含量少于正常二倍体细胞的亚二倍体细胞比率计为凋亡比率。

2.3 线粒体膜电位的观察 线粒体膜电位使用阳离子荧光染料罗丹明 123 进行检测[10]。罗丹明 123 的荧光强度反映线粒体膜电位的高低。细胞培养和药物处理同2.2。弃药液后加入 1 μg/mL 罗丹明 123 染色15 min，并于 37 ℃ 孵育 30 min。弃上清，用 PBS 小心洗 1 次，消化离心，流式细胞仪进行荧光强度检测。或在荧光显微镜下观察细胞形态学变化并拍照。

2.4 免疫印迹法检测蛋白表达 细胞培养和药物处理同2.2，作用至指定时间后，收集贴壁细胞及悬浮细胞，进行蛋白印迹法分析。1 000 r/min 条件下，离心5 min，用PBS 洗2 次，加入裂解液，于4 ℃冰箱内冰浴 1 h 后，13 000×g 离心10 min，收集上清液。用Bio-Rad 法进行蛋白定量，蛋白变性后，每孔上样20 μL。用12% SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质。电泳后将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭后，用相应抗体检测蛋白，一抗室温摇床孵育2 h，放入4 ℃冰箱过夜，次日TBST 洗膜3 次，每次10 min。以辣根过氧化酶标记的二抗封闭液室温摇床孵育2 h，TBST 洗膜3 次。加入ECL 显色，然后采用凝胶成像系统拍照，测定目的蛋白和内参条带的光密度值，计算目的蛋白和内参的光密度比值，进行统计分析。

2.5 统计学分析 实验结果采用SPSS 22.0 统计学软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（）表示。各组间数据比较应用单因素方差分析。

3 实验结果

3.1 抑制超氧阴离子的产生对去甲斑蝥素诱导的细胞凋亡的影响 PI 染色后检测发现，与对照组相比，流式细胞检测结果表明去甲斑蝥素作用24 h 明显增强了subG1 凋亡峰（从1.49%上升至18.74%，P＜0.05）；与去甲斑蝥素作用组比较，SOD 预处理清除超氧阴离子的产生能明显降低subG1 峰值（SOD 加 NCTD 组：4.73% vs.NCTD 组：18.74%，P＜0.05）（图 1）。

图1 去甲斑蝥素诱导HeLa 细胞凋亡

3.2 抑制超氧阴离子的产生逆转了去甲斑蝥素诱导的线粒体膜电位崩溃 使用罗丹明123 染色法评估细胞线粒体膜电位的变化。流式细胞仪分析检测和荧光显微镜形态学观察结果显示，与对照组细胞相比，去甲斑蝥素作用24 h 后明显导致线粒体膜电位的丧失，而用SOD 预处理细胞清除超氧阴离子的产生后，完全逆转了去甲斑蝥素诱导的线粒体膜电位的崩溃（图2）。

图2 去甲斑蝥素对线粒体膜电位的影响

3.3 抑制超氧阴离子的产生对线粒体途径相关凋亡蛋白表达的影响 实验结果表明，与对照组相比，去甲斑蝥素作用24 h 后，Bcl-2 表达量明显下降，Bax 的表达量增加。为了明确超氧阴离子的产生与这些蛋白表达的关系，我们用SOD 预处理细胞清除超氧阴离子的产生，然后加入去甲斑蝥素作用24 h。结果显示，SOD 的加入可以明显逆转去甲斑蝥素单独作用引起的Bax 和Bcl-2 蛋白表达的变化（图3）。

图3 去甲斑蝥素对细胞凋亡相关蛋白表达的影响

4 讨论

去甲斑蝥素是我国自行研制的中药斑蝥有效成分斑蝥素的衍生物，对乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌等妇科肿瘤有抗癌作用[11-12]。宫颈癌属于中医妇科积聚类疾病范畴，其发病与气滞血瘀相关[13]。因此，去甲斑蝥素辅助治疗宫颈癌有较好的疗效，但其抗癌机制尚未明确，仍然值得深入研究。

众多的研究表明，在一些肿瘤细胞系中诱导ROS的生成是抗肿瘤药物发挥其作用的重要手段[14-16]。我们在研究中发现去甲斑蝥素诱导的ROS 主要以超氧阴离子的形式存在，为了明确超氧阴离子的产生在去甲斑蝥素调控HeLa 细胞凋亡中的作用，应用超氧阴离子清除剂SOD 清除超氧阴离子的产生，然后用PI 染色法检测细胞凋亡率。实验结果显示，去甲斑蝥素作用24 h 后明显增强了HeLa 细胞凋亡率，而SOD 预处理后明显降低了去甲斑蝥素诱导的细胞凋亡率，提示超氧阴离子在去甲斑蝥素诱导的HeLa 细胞凋亡中发挥关键作用。

在体内，ROS 的产生和清除在生理情况下处于动态平衡，因此大量的ROS 产生将破坏抗氧化体系的动态平衡，造成氧化应激，导致DNA 损伤，线粒体功能障碍，最终引发内源性凋亡途径诱导细胞死亡[17]。同时，ROS 的爆发总是伴随着线粒体PT 孔开放并进一步诱导线粒体膜电位的崩溃，最终诱发细胞凋亡[18]。我们采用罗丹明123 染色法检测细胞线粒体膜电位完整性，实验结果显示去甲斑蝥素作用24 h 后明显导致线粒体膜电位的丧失，而用SOD 预处理后能够完全逆转去甲斑蝥素诱导的线粒体膜电位的崩溃。以上结果提示，去甲斑蝥素增加超氧阴离子的产生导致线粒体功能障碍及诱导线粒体膜电位的丧失。

线粒体与细胞凋亡的发生关系密切。当线粒体途径的细胞凋亡发生时，会出现Bax 表达增加，Bcl-2 表达降低，两者的比率失衡将进一步加剧线粒体膜电位的崩溃[19]。实验中发现，去甲斑蝥素诱导了线粒体膜电位的下降，Bcl-2 的水平降低，Bax 的表达增加。但加入SOD 清除超氧阴离子的产生后可抑制去甲斑蝥素诱导的膜电位的下降，Bcl-2 的水平降低，Bax 的表达增加这些变化，表明超氧阴离子是去甲斑蝥素诱导HeLa 细胞发生凋亡的主要原因。