抗生素前处理及分析技术研究进展

刘忠玲，王 欣，姚美英，于 维

（吉林大学中日联谊医院, 长春 130012）

抗生素类药物是一类用于干扰其它生物细胞发育功能的天然或人工合成物质，通过抑制细菌细胞壁合成，增强细菌细胞膜通透性，干扰细菌蛋白质合成以及抑制细菌核酸复制转录而达到治疗作用。临床中，药代动力学/药效学与抗菌功效的关系取决于药物的配置，感染的细菌和位置[1]，合理抗生素使用能够极大程度减少ICU患者死亡率[2]，然而，联合使用抗生素间的药物作用、毒性、过敏、抗生素抵抗等不良因素也逐步浮现，而且，抗生素剂量直接关系到频繁抗生素使用的危重症患者安全以及耐药菌株的发展。另一方面，儿童用药效果受生长和成熟相关的生理变化的影响[3]，新生儿的患者间药代动力学差异明显，代谢率和酶含量不同的患者用药效果差异明显，如何合理用药重要性日益显著。因此，抗生素治疗个体化发展势在必行，抗生素监测作为评估用药的基本方法，势在必行。WHO在2014年也对抗生素限制提出了相关政策和约束。

1 抗生素检测研究重要性

抗生素检测不仅在一定程度上避免副作用和毒性，更可以为合理用药提供数据支持，Scaglione等[4]在充分测定病原体和抗生素指标之后，选择相应计量抗生素，其肺炎根除率明显增强。许多研究表明，标准剂量方案往往导致危重病人血液中不同种类化合物偏高。例如，Taccone等[5]在一项研究中发现严重脓毒症和脓毒性休克患者，头孢他啶仅为28%，头孢吡肟为16%，美罗培南为75%，而雷西林—他唑巴坦仅占44%，即使包括急性肾功能衰竭患者（27%）。其它研究也发现重症患者体内抗生素浓度部分比例较高、部分不足的情况[6]。最近，欧洲联盟委员会发布了一份文件“人类健康中谨慎使用抗菌药物的指南”[7]，其中倡议广泛开展抗生素检测，改善对耐药病原体和危及生命的感染的诊断测试。目前，抗生素检测领域已有大规模微量抗生素联合检测的论文，如磺胺类[8]、氟喹诺酮类[9]、β-内酰胺类[5]、大环内酯类[10]、氨基糖苷类[11]、四环素类[12]等。Lefeuvre等[13]同时检测血液中15种抗生素，包括青霉素（阿莫西林、苯唑西林、哌拉西林和替卡西林)、头孢菌素（头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶和头孢曲松）、碳青霉烯类(厄塔培南、亚胺培南和美罗培南），林可酰胺（克林霉素），喹诺酮类（氧氟沙星和环丙沙星）和他唑巴坦，线性范围0.5～32 mg/L，最低检出限为0.02～0.1 mg/L，符合抗生素联合检测的相关要求。

2 抗生素前处理技术进展

临床用药中抗生素联合分析要求其检测范围广、灵敏且稳定，如何纯化与分离待测样品至关重要，例如，血液、尿液、粪便。液相微萃取技术[14]始于1990年，由于分子结构、大小、物理化学性质及药物浓度的巨大差异，传统单一抗生素分析的前处理技术不能满足联合抗生素分析，尤其是对于化学结构类似的同类抗生素更具有很大困难。从直接进样到调节pH优化[15]再到不同种类的固相萃取住分离[16]与液相微萃取[17]，克服不同基质对被分析物测定影响，被广泛应用在抗生素监测中。

2.1 固相萃取法

血液、尿液与粪便等基质相对复杂，有机溶剂萃取能够在一定程度上纯化样品，降低杂质峰干扰，所以在这类基质前处理中SPE和SPME经常被使用。其过程主要分为活化、上样、淋洗和洗脱四部分，通过使用不同材料可以针对不同结构的抗生素达到最大的纯化、分离和富集效果。不同种类的SPE柱如Oasis、Bond柱在抗生素分析中长被使用[18]。2018年Olga等[19]利用C18柱上进行固相萃取用于定量测定血浆和尿液中阿霉霉素，进而开展药代动力学及药物监测疗法的研究，在临床中将其应用于监测小儿癌症患者中的阿奇霉素含量测定并评估医护人员暴露量。李龙等[20]在固相萃取基础上建立注射器内膜固相萃取装置，以荧光胺为衍生剂，实现同步化衍生萃取体系测定磺胺甲恶唑。赵颖雅等[21]通SPE板萃取测量胎粪中的抗生素暴露量，进而评估怀孕期间累积的抗生素暴露量对胎儿生长的影响。Malgorzata等[22]利用C18固相微萃取柱实现人血中11种抗生素检测及其药物代谢动力学研究，通过基质辅助激光解吸/电离 飞行时间质谱 （MALDI /TOF-MS）对目标化合物的定性及定量分析。

2.2 液相萃取法

随着液相萃取技术发展，萃取剂用量少、快速、简便、微型化的萃取技术已逐渐成为主流，在其基础上发展的液相微萃取[23]、液液分散微萃取[24]等技术逐渐在抗生素检测前处理中广泛应用，尤其对于血液中磷脂基质干扰，液相萃取无疑为最好的选择。2020年最新实验表明，Natalia等[25]利用液液萃取技术结合表面增强拉曼光谱技术成功用于检测尿液中磺胺甲恶唑，实验酸化稀释的尿液并通过氯仿提取和抑制背景信号，使用银纳米颗粒作为底物在30 min内全部检测流程，其最低检出限低至1.7 μg/mL。依据萃取溶剂与基质的接触方式，液液分散微萃取主要分为三大类：1）单滴微萃取；2）中空纤维膜微萃取；3）分散液液微萃取。基于各种萃取技术在抗生素实际检测中基质复杂程度及被分析物特点加以不同辅助手段亦可在一定程度上提升前处理效果，例如，微波辅助、超声辅助、空气辅助、涡流辅助及离子液体等[26]。Vincenzo等[27]对医院获得性肺炎患者血浆中抗生素进行分析，血样处理中加入氯化钠和氢氧化钠进行预处理，将1-十二烷醇作为萃取溶剂，将注射器作为萃取容器反复抽拉，过程中萃取溶剂以小液滴形式分散在基质中进行萃取，离心后，1-十二烷醇的浮在表面上的有机液滴固化，利用有机溶剂溶解分析。贾少东等[28]利用有机液滴固化和分散液-液微萃取联合应用定量人尿中5种大环内酯类抗生素，结果表明最低检测限为10～40 ng/mL，日内和日间精度小于8.7%和12.6%，绝对回收率值约为100%。

2.3 双水相体系萃取

双水相体系分离基质中利用被分析抗生素在两相间的分配系数不同，而进行纯化与富集的一种技术，近年来广泛在生物大分子提取及检测中广泛应用。常见的双水相体系包括高分子聚合物双水相、表面活性剂双水相、小分子有机溶剂双水相及离子液体双水相。王芸等[29]就抗生素在乙醇/ 2-丙醇-硫酸铵两相分配行为和分配机理进行详细阐述，结果显示四环素盐酸盐在pH=1.52时，该双水相体系分配系数和回收率可以达到30.03%和87.70%，也进一步验证了小分子有机溶剂双水相体系在分析方面的应用原理与前景。Afshin等[32]利用氯化胆碱/磷酸钾双水相体系萃取头孢氨苄，并优化了两相配比、盐离子效应及温度，实现了以分离为目的的高质量药物分离、提取与分析。

3 抗生素样品检测技术

危重症患者多种类、覆盖性检测尤为重要，这需要相应匹配的检测技术，目前，不同基质中抗生素检测取得长足的发展，在灵敏度及稳定性方面都得以极大提升，尤其质谱等高精度检测仪器的应用，使得低含量抗生素分析及代谢研究的得以广泛应用。通过分析2015年至今抗生素在人体体液、代谢等方面的分析检测技术（见图1），结果显示HPLC是抗生素检测的主流技术。

图1 2015年至今人体体液、代谢领域抗生素检测技术分布

3.1 色谱分析方法

高效液相色谱（HPLC）技术在一定程度上可以实现多种目标物质的有效分离，同时针对抗生素种类及结构特点，搭配串联不同类型检测器是目前最常使用的分析手段。近年来，MS[33]、二极管阵列（DAD）[34]、紫外（UV）、荧光（FLD）[35]、电化学检测器[36]等检测器都是抗生素分析中经典分析技术，其中MS由于其灵敏度高且可用于结构及代谢分析等优势成为目前最常用的检测器。尤其是对联合使用抗生素分析，Giancarlola Marca等[37]利用LC/MS定量儿童干血斑上的利奈唑胺，并验证其在干血斑纸上的稳定性可维持至少1个月。Detosterd等[38]利用甲醇沉淀血浆蛋白并进行MS检测重症细菌感染患者中美洛培南，头孢吡肟中12种抗生素。在最新研究中，Marta等[39]利用液相色谱-四极杆飞行时间质谱法测定尿样中的苯酚类抗生素及其葡萄糖醛酸代谢产物，使用β-葡萄糖醛酸苷酶和硫酸酯酶酶解以区分游离形式和结合形式，利用分散液微萃取进行前处理，结果显示最低检出限低至29.6～3 pg/mL，极大程度提高检出限。通过减少填充物粒径，形成超高效液相色谱进行抗生素测定可以提高分析方法的效率，同时减少分析时间和溶剂消耗量，Sophie等[40]利用MS在2.75 min内同时测定人血清中阿莫西林，阿奇霉素等7种抗生素。然而，由于质谱仪器对于流动相要求较高，价格昂贵，并且一些前处理技术中使用的萃取溶剂会对仪器造成一定影响，因此并不具有广泛适用性。

紫外检测器作为最广泛使用的经典检测器，许多抗生素在紫外区均有较强的吸收，例如，磺胺类抗生素通常选取270～280 nm吸收波长[41]，氟喹诺酮类抗生素255～275 nm[42]，β-内酰胺类抗生素210～304 nm[43]，Paola等[44]利用紫外检测器在220 nm、298 nm波长下同时测定血浆样品中万古霉素、美罗培南、哌拉西林和他唑巴坦的血浆水平，这些都是ICU治疗中的单药或联合使用的抗菌剂。Nadine等[43]利用UV检测器进行β-内酰胺类抗生素血液药物监测中哌拉西林，美罗培南，头孢他啶和氟氯西林等因素影响，结果显示β-内酰胺血浆样品可以在-80 ℃下可保存 9～13个月，美罗培南和哌拉西林的化合物在4 h和6 h 后几乎全部降解。荧光检测器在β-内酰胺类抗生素[45]、磺胺类抗生素[22]检测中也经常使用，其测定结果也能够达到较低检出限，但对于一些荧光信号低等抗生素在检测前通常采取衍生化处理，由于操作复杂，且需要衍生化并不被常规使用。DAD检测器在任意波长中均可等到相应色谱图但相较于FLD灵敏度低。

3.2 免疫分析法

免疫分析技术是目前最适合实验室推广且日常可操作性强的检测技术，其灵敏度高、专一性强、适用于批量检测检测等技术在临床检测中被广泛应用，包括放射性免疫、发光免疫、酶联免疫吸附[46]和免疫传感器等。目前，大部分抗生素均已建立免疫测定法，如四环素、磺胺二甲基嘧啶、氯霉素等。韩帅娟等[47]利用胶体金的比色试纸法测定血液和尿液磺胺类和四环素类等26种药物，其最低检出限分别为3～4 ng/mL；和4.5～6 ng/mL，回收率在78.4%～112.6%之间。

3.3 毛细管电泳法

毛细管电泳法分离抗生素是以高压电场为驱动力，不同组分抗生素在毛细管中由于淌度和分配行为上的差异而实现分离。Thi Ngoc等[48]使用电容耦合非接触式电导率毛细管电泳仪测定越南重症患者中多利培南，美罗培南，亚胺培南和厄他培南四种碳青霉烯类抗生素，实验中使用CE-C4D药物控制及质量监测工具，其最低检出限为0.36 mg/L和0.45 mg/L。Prasanta等[49]总结此项技术从药物质控角度分析不同原理毛细电泳设备实现青霉素、氟喹诺酮、大环内酯类和林可酰胺四类多种抗生素快速分析，这类方法不仅增加了检验方式便携性，而且满足经济性等要求。

3.4 薄层色谱

薄层色谱用于定性和定量分析的最简单的色谱分离技术之一。它适用于测定易降解且光谱与其降解产物强烈重叠的化合物。Khalid等[50]利用TLC-光度法和分光光度法在碱诱导下测定头孢西丁钠降解产物，结果显示以甲醇为溶剂层色谱-光度法灵敏度较以水为溶剂一阶导数分光光度法灵敏度高。陈丽王双英等[51]总结薄层色谱的基础上结合生物自显技术应用，将色谱层（吸附剂或纸）置于接种过细菌的琼脂盘上或置于细菌悬浮液中，再进行培养，寻找抗细菌、抗真菌药物及进行药品质控。

4 结语

近年来，不断有各种前处理技术被开发用于药物分析中，涉及毒性、代谢、药物浓度检测等不同用途中，就分析过程而言，前沿前处理技术在实际消耗量及通量方面都有很大程度进步。当今，大部分的抗生素检测都在HPLC串联质谱进行，在代谢产物结构分析及精准定量方面都显示其优势，但设备及维护成本相对较高，随着检测技术的发展，高效、灵敏、便携的检测设备及方法将被相继开发，小型化检测设备研究将成为在药物临床监测领域重点，随着研究深入发展，抗生素分析及前处理将取得较大进步并直接引导临床用药精准化、个体化化发展。