精索静脉曲张对精子DNA碎片、活力、形态及体外受精结局的影响

曾广旦 广东省深圳市宝安区宝安中医院集团检验科 518101

精索静脉曲张(VC)是指精索静脉受损、瓣膜功能失常或减弱等原因造成精索静脉变形、屈曲、伸长，是导致男性不育的常见病因[1]。目前VC导致男性不育的原因可能与精液质量降低及精子活力改变相关，其具体机制尚未完全阐释清楚[2]。现有研究证实，精子细胞核DNA碎片率异常升高是某些男性不育的病因，而VC患者精液中可检测到过量活性氧的存在，过量的活性氧物质可引发精子DNA的断裂，使DNA碎片增加，增加男性不育的风险[3]。为探究VC患者精液、精子相关参数的变化及与不育的关系，本文比较了VC患者及健康已育男性志愿者精液质量及精子相关参数，并与近期进行体外受精(IVF)受试者妊娠结局进行比较，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年6月—2019年6月我院收治的60例伴有VC的男性不育患者纳入VC组，所有患者均采用临床查体并结合彩色多普勒超声确诊，排除其他目前已知的可导致不育的疾病及环境因素；另择同期于我院检查的50例健康已育男性志愿者作为对照组；选择本院同期进行体外受精的556例患者为同期组。VC组患者年龄27～36岁，平均年龄(31.22±3.38)岁；对照组年龄26～37岁，平均年龄(30.96±4.02)岁；同期组年龄27～38岁，平均年龄(31.44±3.96)岁。各组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 (1)精液常规形态学分析：嘱受试者禁欲2～7d，收集新鲜精液置于取精杯，37℃恒温培养，精液完全液化后进行精液常规参数测定；进行HE染色，按照Kruger评分标准[4]进行形态学分析。(2)染色质扩散实验：①采用培养液将液化的新鲜精子标本浓度调至5×106/ml，取50μl已融化的1%低熔点琼脂糖与20μl稀释的精液标本混匀，吸取混合液20μl滴在预先用1%琼脂糖包被的载玻片上，盖上盖玻片，将标本置于4℃冰箱内5min以使琼脂糖凝固，小心移去盖玻片，留取载玻片备用。②载玻片置于0.08mol/L的HCI溶液中8min，小心取出放入中和裂解液Ⅰ中15min；然后取出放入中和裂解液Ⅱ中5min，最后取出放于TBE缓冲液2min；将处理好的载玻片分别放入浓度为70%、90%、100%的乙醇溶液中逐级脱水，每种溶液处理2min，脱水完毕后取出备用。③将瑞氏染液与磷酸缓冲液按照1∶1的比例混匀，将玻片置于混合染色液中染色10min，蒸馏水冲洗并自然晾干。④在显微镜下进行500个精子计数，参考Fernandez标准进行分级，分为大光晕精子(晕轮宽度≥核心较小直径)、中光晕精子(晕轮宽度介于大晕圈及小晕圈之间)、小光晕精子(晕轮宽度≤1/3×核心较小直径)、无光晕精子及退化精子；其中小光晕、无光晕精子及退化精子为DNA损伤精子。(3)IVF-胚胎移植：①促排卵：从月经周期第21天时给予促性腺激素释放激素激动剂皮下注射，达到降调节标准后，给予促性腺激素注射，当观察到3个主导卵泡直径达18mm时停止给药，停药当晚给予人绒毛膜促性腺激素(HCG)1 000IU肌注，36h后进行穿刺取卵。②IVF：取卵当日常规授精，16～18h后观察授精情况，可见2个原核及第二极体即为正常授精；授精成功后42h及72h可观察卵裂情况。

1.3 观察指标 进行形态学分析统计前向精子活力、精子浓度、正常形态精子率及圆形细胞数；计算受试者精子碎片率(DFI)、IVF受精率、卵裂率及妊娠情况：其中精子DFI=DNA损伤精子/500×100%；IVF受精率=受精胚胎数量/卵子数量×100%；生化妊娠的标准为行胚胎移植后14d可测定血清β-HCG≥25mUI/ml。

2 结果

2.1 VC组与对照组精液常规参数比较 VC组患者精液体积、精子浓度、前向精子活力、正常精子形态等参数均明显低于对照组(P<0.05)；两组受试者圆形细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 VC组与对照组精液常规参数比较

2.2 VC组与对照组精液精子碎片率比较 VC组患者大光晕精子比率明显少于对照组(P<0.05)，中光晕、小光晕、无光晕及退化精子比率明显高于对照组(P<0.05)，DFI明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 VC组与对照组精液精子碎片率比较

2.3 VC组及同期组妊娠相关指标比较 VC组受精率、卵裂率均明显低于同期组(P<0.05)。见表3。

表3 VC组及同期组妊娠相关指标比较

3 讨论

VC是因精索内静脉丛回流受阻或瓣膜失效等引起的血液流动受阻，长期发展即可导致静脉丛蔓延伸长[5]。既往研究表明，VC的发生与睾丸体积下降密切相关，VC可能可直接导致睾丸功能降低[6]；另有研究表明，VC可导致精子活力及正常精子所占比率下降[7]。本文对比了VC患者及对照组健康受试者精液质量，结果显示VC组患者伴有精液体积、精子浓度、前向精子活力、正常精子比率降低，提示VC的发生与精液质量具有较强的相关性。

本文结果显示，与对照组健康者比较，VC患者DNA正常精子比率明显降低，异常比率明显升高，精子碎片率明显升高，提示VC患者存在精子DNA碎片化升高现象。目前认为VC导致精子碎片化的机制可能与机体氧化应激反应升高相关，过量的氧化应激可导致精子细胞膜损伤，引发精子细胞核破裂及核DNA碎片增多，另外细胞核的破坏可使精子DNA直接暴露在活性氧物质中，导致DNA链断裂及破坏[8]。对妊娠结局进行分析，结果显示VC患者IVF受精率及卵裂率较低，提示VC可降低受精率，结合前述结论，VC患者DNA正常精子比率降低可能为受精率降低的相关机制之一。精子DNA完整性是IVF授精成功的必要因素，精子DNA碎片的增加可减弱精子染色质的稳定性[9]。既往刘群龙等[10]研究证实与精液正常者比较，VC患者优质胚胎率及临床妊娠率存在一定的下降趋势；而崔险峰等[11]证实VC患者优质胚胎率及生化妊娠率与同期进行IVF受试者比较无明显差异，本文中优胚率及生化妊娠率与后者研究结果类似，分析其原因，可能为我院同期进行IVF的受试者以不同原因导致生育功能下降的患者居多，导致优质胚胎率较低，两者比较并无明显差异，因此VC对临床妊娠的影响仍需进一步研究验证。

综上所述，VC患者可伴有异常形态精子比率升高、活力降低及精子碎片率升高，另外也可导致IVF受精率、卵裂率降低，对妊娠结局有不良影响。