脊神经后根切断对兔膝关节软骨及本体感觉的影响

2021-08-24胡荣庭陈朝晖王婷婷

海南医学院学报 2021年16期

胡荣庭，陈朝晖，王婷婷

（安徽中医药大学1.研究生院，2.安徽中医药大学针灸推拿学院（康复医学院），安徽合肥， 230038）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退行性改变为主要特征的慢性退行性骨关节疾病，疼痛、肿胀和功能障碍是其典型表现。临床研究指出［1］，OA 患者均存在不同程度的本体感觉减退，与疼痛、关节功能均存在正相关性。本体感觉较差的患者表现出更低程度的姿势控制和平衡稳定性，以及更高程度的关节功能活动受限［2，3］。以此为依据，部分研究者对OA 患者进行本体感觉康复训练，患者的肌力、疼痛以及稳定性均有效改善，关节功能活动能力提高［4，5］。本体感觉与OA 的联系已经得到广大学者的认同，其临床效果也已得到验证，基础实验方面多以破坏膝关节本体感受器的重要载体-前交叉韧带，探讨本体感觉与膝关节功能活动、骨关节炎之间的联系。但是前交叉韧带本身就是维持膝关节稳定性的关键结构，通过损伤前交叉韧带观察本体感受器以及关节软骨的病理改变有失偏颇，无法明确本体感觉在其中发挥的作用。因此，本研究在切断兔脊神经后根保留其运动能力的基础上复制本体感觉障碍动物模型，以实验动物行为学变化、关节软骨病理改变、本体感受器的变化以及电生理的检测，探讨感觉缺失对关节软骨的影响，为OA 的发病机制以及临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物分组

由安徽中医药大学动物中心提供成年健康SPF 级新西兰大白兔20 只，雌雄各半，单笼饲养，自由饮水摄食，体重2.0～2.5 kg。实验遵循国家制定的实验动物管理与使用指南，并通过安徽中医药大学医学伦理委员会批准（批号：AHUCMrabbits-2019010）。根据随机化原则将动物进行分组：对照组9 只，模型组11 只。

1.2 造模

采用脊神经后根切断法进行模型的制作［6，7］：术前禁食12 h。3%戊巴比妥钠（3.0 mL/kg）耳缘静脉注射麻醉，兔俯卧位固定，手术范围内备皮，常规消毒，于兔右后背肋骨下第三、四节棘突旁1 cm 做一纵型切口，打开皮肤、皮下筋膜显露棘突后，钝性分离棘旁肌肉，暴露L5-L6上下关节突及横突，使用玻璃分针从椎间孔进入离断L5-L6脊神经后根。最后止血、生理盐水冲洗、逐层缝合切口。术后连续3 d 肌注青霉素20 万U/d，并用0.5%碘伏每日消毒，积极预防感染。常规饲养。

1.3 主要试剂和设备

苏木素、伊红染色液（货号BA4041、BA4022，Baso）；Bielschowsky 神经染色（货号G2306，Solarbio）；tunel 细胞凋亡检测试剂盒（货号C1098，Beyotime）；蛋白酶K（货号ST533，Beyotime）；石蜡切片机（型号Shandon Finesse325，Therom）；光学显微镜（型号Nikon eclipse 50i，Nikon）。

1.4 检测指标及实验方法

1.4.1 实验兔行为学评价实验结束后即术后第8 周观察兔的运动情况，兔后肢运动功能依据改良的Tarlov 分级法［8］进行评价。正常情况下兔后肢运动评分为5 分。

1.4.2 电生理检测［9］采用乙醚吸入+1% 利多卡因对兔进行局部麻醉，固定其头部及四肢，从髌内侧进入关节腔暴露前交叉韧带。体感诱发电位（SEPs）的检测是将记录电极点放置在兔头正中矢状线与两眶后缘的连线交点旁开0.2 cm，再往后移0.5 cm 处。皮层参考电极放置鼻根部皮下，下肢近端放置皮下电极接地，检测开始后记录潜伏期和波峰。EMG 的检测是在上述操作完成后将记录电极放置于腘绳肌肌腹内，参考电极放置于内踝。双极表面电极于前交叉韧带股骨端和胫骨端进行电刺激，强度为18～20 V。

1.4.3 关节软骨组织形态学观察及Mankin's 评分电生理检测结束后将完整取下的膝关节置于10% 福尔马林溶液中固定。48 h 后再经过以下步骤：脱钙、二次取材（仅取股骨内侧髁部分软骨组织）、脱水、包埋、制作成蜡块，切片后行HE染色，光镜下观察关节软骨组织的软骨细胞数量、软骨基质染色、软骨潮线、软骨结构情况，拍照留存，并对软骨组织行Mankin′s 评分。

1.4.4 Bielschowsky 神经染色［10］取右膝关节前交叉韧带，经氨银溶液、海波溶液、氯化金溶液等溶液浸泡后制成蜡块，切成厚度为10 μm 的切片后使用光学显微镜观察，镜下神经元、轴突、神经纤维为黑色。需要注意的是石蜡切片需标记股骨端、中间部和胫骨端，计数本体感受器数量。

1.4.5 TUNEL 软骨细胞凋亡测定取HE 染色时制备的蜡块继续切片，厚度为3 μm，经脱蜡、脱水透明后严格按照TUNEL 试剂盒上的步骤，依次加入蛋白酶K、过氧化物酶、TUNEL 反应液、HRP、DAB 显色液、苏木素等溶液，最后中性树胶封片，显微镜下观察软骨细胞调往情况并摄片留存。凋亡指数（apoptosis index，AI）［11］：每张切片随机选取5 个含有细胞凋亡数相对最多的高倍视野（×400），计算100 个软骨细胞中凋亡细胞所占的百分比。

1.5 统计学处理

利用SPSS 23.0 软件对所有数据进行统计学的分析和处理，计量资料均使用均数±标准差（±s）表示。样本实验数据满足独立、正态、方差齐性使用t检验，不满足条件时则使用非参数秩和检验进行统计分析。统计结果均以P＜0.05或P＜0.01 表示实验数据具备统计学差异。

2 结果

2.1 兔行为学改变

模型组兔术后第2 天，右后肢不能正常活动，不能协调运动，呈被动拖动、瘫痪状态。随着实验过程的进展至术后8 周，兔运动功能基本正常，但有2只兔运动功能仅达到3 级，考虑是否与手术创伤、损伤脊神经前根有关。对照组术后功能活动正常。见表1。

表1 两组兔改良Tarlov 评分标准比较（分，±s）Tab 1 Comparison of modified Tarlov scoring standard between the two groups（points，±s）

组别对照组模型组n 9 1 1 t P Tarlov 评分5.00±0.00 4.54±0.82 1.838 0.096

2.2 SEPs 和EMG 潜伏期及波幅变化

与对照组相比，模型组SEPs 和EMG 的潜伏期延长，波幅下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组SEPs 和EMG 潜伏期及波幅变化（±s）Tab 2 Latency and amplitude changes of SEPs and EMG in two groups（±s）

组别n 9 1 1 SEP潜伏期（ms）13.89±2.61 18.64±3.17*-3.594 0.002对照组模型组t P波幅（μV）20.89±2.20 13.09±3.21 6.181 0.000 EMG潜伏期（ms）5.78±1.99 12.09±3.05-5.341 0.000波幅（μV）0.43±0.39 0.13±0.21 2.228 0.039

2.3 兔组织形态学观察及Mankin's 评分

光镜下观察，对照组关节软骨表面光滑平整，层次结构清晰，软骨细胞分布均匀，呈柱状排列，形态正常，未见簇集；模型组关节软骨表面消失，层次结构紊乱，软骨基质着色不均，软骨细胞分布不均，数量减少，偶见簇集。与对照组相比，模型组关节软骨损伤更为严重（P＜0.01）。见图1、表3。

表3 两组兔Mankin’s 评分比较（分，±s）Tab 3 Comparison of Mankin's score between the two groups（points，±s）

组别对照组模型组n 9 1 1 t P Mankin's 评分0.33±0.50 3.72±0.79-11.200 0.000

图1 两组关节软骨组织形态学观察（HE，400×）Fig 1 Morphological observation of two groups of articular cartilage tissues（HE，400×）

2.4 兔本体感受器及数量变化

对照组韧带中本体感受器数量无明显变化，神经元形态基本正常，分布均匀，韧带组织结构致密；模型组本体感受器数量明显减少，形态出现不规则改变，韧带组织结构松散发生固缩。与对照组比较，模型组本体感受器数量明显减少差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图2、表4。

表4 两组兔本体感受器计数比较（个，±s）Tab 4 Comparison of the number of proprioception between the two groups（PCs.，±s）

组别对照组模型组n91 1 tP本体感受器26.11±3.22 10.36±2.80 11.699 0.000

图2 本体感受器Bielschowsky 神经染色结果（400×）Fig 2 Proprioceptor Bielschowsky nerve staining results（400 ×）

2.5 TUNEL 及软骨细胞凋亡率

TUNEL 实验结果显示，模型组的软骨细胞凋亡数明显高于对照组，关节软骨损伤严重，也说明本体感觉障碍对膝骨关节的发生、发展均有影响（P＜0.01）。见图3、表5。

表5 两组兔软骨细胞凋亡率比较（%，±s）Tab 5 Comparison of chondrocyte apoptosis rate between two groups（%，±s）

组别对照组模型组n91 1 tP凋亡率9.20±1.30 52.00±4.24-21.562 0.000

图3 软骨细胞凋亡TUNEL 实验结果（400×）Fig 3 TUNEL test results of chondrocyte apoptosis（400×）

3 讨论

本体感觉是感知关节位置与运动，维持关节稳定性的重要因素。膝关节的本体感觉主要通过膝周的韧带、肌肉、半月板等组织接收运动觉、位置觉等信息，经传入神经传递至不同中枢系统，综合分析整合后，再通过调节Y 运动神经元将信号传至效应器，进而支配膝关节肌纤维，调节其肌张力，维持膝关节运动和稳定性［12，13］。本实验为了探究本体感觉缺失与关节软骨退变之间最直接的联系，采用了脊神经后根切断法，主要有两方面原因。其一，脊神经根包括以运动神经纤维为主的前根和以感觉神经纤维为主的后根，切断后根可以在保留动物运动功能的基础上破坏其感觉功能，阻隔“感觉信号”的传输，直观展示本体感觉障碍对关节软骨的影响。L5-L7是兔股神经干躯体传出和传入的主要节段，其中L5-L6是股神经干躯体传出的优势节段［7］。模型组通过离断L5-L6脊神经后根，破坏完整的本体感觉传导通路，改变了肌肉张力和协同，造成膝关节稳定性下降以及应力失衡，最终造成关节软骨破坏的结果。其二，改良Hult 法是OA 的经典造模方法，主要通过离断内侧副韧带、前交叉韧带，切除内侧切半月板等结构，造成下肢应力失衡，加速软骨退行性改变。但此种造模方法为有创性损伤，无法保留完整的前交叉韧带，不仅会引发出血、滑膜炎症等，而且损伤了膝周的效应器，严重影响本体感觉对膝骨关节炎进展的研究。

本体感受器是人体接收外在刺激的重要装置。相较于膝关节其他组织，前交叉韧带含有更丰富的本体感受器，可以感受关节、肌肉的应力和拉力，参与膝关节的运动和稳定性控制［14，15］。有研究证实［16，17］，患者ACL 损伤后，随着时间推移机械感受器数量逐渐减少，只残留少量游离神经末梢，膝关节不稳定感明显，本体感觉基本消失。本体感受器数量减少，传入中枢系统的本体感觉信息缺失，会造成中枢系统对神经肌肉的控制能力减弱，关节运动协调性和稳定性下降，进而可能改变下肢生物力学模式，促进骨关节炎的发生发展。有学者［18］针对OA 患者进行本体感觉强化训练，结果发现患者关节平衡能力和稳定性提高，骨关节炎症状得到缓解。这也间接证实了本体感觉障碍在OA 的形成与发展中扮演着重要的角色。本实验通过使用Bielschowsky 神经染色法观察本体感觉传导通路切断后本体感受器的变化，对照组韧带中本体感受器数量、形态无明显变化，分布均匀，结构完整，韧带组织结构紧密，而模型组韧带本体感受器数量明显减少，形态存在不规则改变，不规则的稀疏分布，韧带组织结构松散，两组比较具有统计学意义（P＜0.01）。

目前SEPs 和EMG 是检测实验动物本体感觉公认的有效设备［9］。在本实验中，SEP 的变化主要反应本体感觉传导通路的完整性和功能状态，而EMG 的变化主要反应相关肌群（腘绳肌）反射性收缩的能力。检测结果显示，与对照组相比，模型组动物SEPs 和EMG 的潜伏期延长，波幅降低，说明本体感觉传导通路的功能活动受限，无法正常参与膝关节的信号传导，对相关肌群神经肌肉控制能力减弱，可能导致膝关节不稳感明显，加重关节软骨损伤。这也从侧面说明，本体感觉障碍可能造成骨关节炎的发生发展。OA 发生发展的病理基础是关节软骨的退行性改变，其主要由软骨细胞和软骨基质构成，其中软骨细胞是关节软骨内唯一的细胞类型，具有分泌和维持软骨基质，调节软骨代谢的功能［19］。软骨细胞始终存在一定比例的凋亡现象，有利于保证软骨的正常结构和功能。但是软骨细胞过度凋亡，超过其增殖数目，则会影响关节软骨的形态、抗压特性等。通过TUNEL 实验和HE 染色我们可以观察到，实验动物发生本体感觉障碍后，关节软骨表面损伤严重，软骨细胞排列紊乱，软骨基质染色不均，软骨细胞凋亡率显著上升。可见，本体感觉障碍能够促进关节软骨的退行性改变。

综上所述，本实验通过模拟膝关节本体感觉障碍模型，从基础病理层面表明了本体感觉缺失可以造成软骨细胞过度凋亡，关节软骨退行性改变，有助于膝骨关节炎的发生和发展。