甲状腺癌组织中长链非编码RNA浆细胞瘤变体易位1和微小RNA-195-5p表达及临床意义

李小玲 邵 馨 郭 玲 杨亚丽

1.江苏省常州市中医医院病理科，江苏常州 213000；2.南通大学附属启东医院病理科，江苏启东 226200；3.云南省第二人民医院病理科，云南昆明 650021

甲状腺癌是一种常见的内分泌恶性肿瘤，发病率逐年上升，严重影响人类健康[1]。尽管甲状腺癌的治疗技术较成熟，但对于晚期甲状腺癌和恶性度较高的病理类型术后的复发率仍较高。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）不能参与转录和翻译过程，但可以参与基因网络的调节，从而调控蛋白质活性[2]。浆细胞瘤变体易位1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）位于染色体8q24.21，包含1716个碱基，在乳腺癌中其基因拷贝数明显增加，可能对乳腺癌的进展具有一定影响[2]。研究发现[3]，沉默lncRNA PVT1 能够促进黑色素瘤细胞凋亡，抑制其增殖活性，通过诱导其靶基因使癌细胞停滞在G0/G1期。微小RNA（miRNA）是在细胞中广泛存在的非编码RNA 分子，能够参与个体形态形成、脂类代谢以及胚胎发育等生命活动。研究显示[4]，miR-195-5p 能够抑制细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白活性，使癌细胞阻滞在G1/S 期，从而抑制癌细胞的分化和增殖。有研究发现[5]，lncRNA PVT1和miR-195-5p 均可作用于多梳蛋白共同参与癌变进展。因此，本研究旨在探讨甲状腺癌组织中lncRNA PVT1、miR-195-5p表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析江苏省常州市中医医院（以下简称“我院”）于2017 年4 月至2020 年1 月收治的82例甲状腺癌患者的临床资料。纳入标准：①符合《世界卫生组织肿瘤分类诊断系统》[6]中的诊断原则，且术后病理证明为甲状腺癌；②均自愿配合本研究，且具有完整的基本资料；③首次确诊。排除标准：①合并严重甲状腺功能亢进；②伴有巨大甲状腺肿或桥本性甲状腺炎者；③合并其他原发性恶性肿瘤者；④先天性免疫功能障碍者；⑤严重肝肾功能不良者而不能耐受手术或放化疗者。同时按照1∶1 选取同期我院年龄性别相匹配的82例行甲状腺部分切除术的甲状腺良性肿瘤作为对照。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

采用荧光实时定量PCR技术测量lncRNA PVT1和miR-195-5p的相对表达量。将术中切取的甲状腺癌组织、癌旁正常组织（距癌组织边缘3 cm 处）及甲状腺良性肿瘤组织各30 mg 放入液氮中暂存，术后转存于-80℃冰箱中。先在冰面上研磨均匀，然后滴加1 ml Trizol 试剂（Invitrogen 公司；批号：20170321）提取总RNA。将总RNA 通过PrimeScriptTMRT reagent Kit 试剂盒（TaKaRa 公司；批号：20170126）反转录为cDNA。使用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa 公司；批号：20170219）定量检测，逆转录条件均为37℃15 min，85℃5 s。PCR 扩增体系：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μl、dH2O 7.8 μl、Rox 0.4 μl、cDNA template 1.0 μl 及正反向引物各0.4 μl，共20.0 μl。miR-195-5p的正向引物序列为5’-GATAGCAGCACAGAAATATTGGG-3’、反向引物序列为5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，内参基因β-actin的正向引物序列为5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3’、反向引物序列为5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’；lncRNA PVT1正向引物序列为5’-GCTGTGGCTGAATGCCTCAT-3’、反向引物序列为5’-TTCACCAGGAAGAGTCGGGG-3’，内参基因GAPDH 正向引物序列为5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’、反向引物序列为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。lncRNA PVT1和miR-195-5p的PCR 反应条件均为预变性95℃3 min、变性95℃15 s、退火65℃30 s、延伸72℃20 s，扩增40 个循环，样本均测量3 次。引物序列由北京六合华大基因科技有限公司负责制造。以相对Ct 值法检测lncRNA PVT1和miR-195-5p的表达量，以ΔCt 值作为结果，二者相对于GAPDH和β-actin的比值为2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct 目的基因ΔCt 内参基因。

1.3 统计学方法

SPSS 22.0 软件统计分析数据。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较应用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。两组间比较应用独立样本t 检验。相关性检验应用Pearson 相关分析。以P ＜0.05 为差异有统计学差异。

2 结果

2.1 不同甲状腺组织中lncRNA PVT1、miR-195-5p相对表达量比较

甲状腺癌组织中lncRNA PVT1 相对表达量高于甲状腺良性肿瘤组织及癌旁正常组织、而miR-195-5p 相对表达量低于甲状腺良性肿瘤组织及癌旁正常组织（均P ＜0.05），癌旁正常组织与甲状腺良性肿瘤组织中lncRNA PVT1、miR-195-5p 相对表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图1、表1。

表1 不同甲状腺组织中lncRNA PVT1、miR-195-5p相对表达量比较（±s）

表1 不同甲状腺组织中lncRNA PVT1、miR-195-5p相对表达量比较（±s）

注：与癌旁正常组织比较，aP ＜0.05；与甲状腺良性肿瘤组织比较，bP ＜0.05。lncRNA PVT1：长链非编码RNA浆细胞瘤变体易位1；miR-195-5p：微小RNA-195-5p

图1 lncRNA PVT1、miR-195-5p 琼脂糖凝胶电泳图

2.2 甲状腺癌组织中lncRNA PVT1、miR-195-5p表达与临床病理的关系

甲状腺癌组织，lncRNA PVT1 在有淋巴结转移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期中相对表达量高于无淋巴结转移及Ⅰ～Ⅱ期；miR-195-5p 在有淋巴结转移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期中相对表达量低于无淋巴结转移及Ⅰ～Ⅱ期（均P ＜0.05）；二者在不同年龄、性别、肿瘤大小、病理类型中表达量比较，差异无统计学意义（均P ＞0.05）。见表2。

表2 甲状腺癌组织中lncRNA PVT1和miR-195-5p表达与临床病理的关系（±s）

表2 甲状腺癌组织中lncRNA PVT1和miR-195-5p表达与临床病理的关系（±s）

注：lncRNA PVT1：长链非编码RNA浆细胞瘤变体易位1；miR-195-5p：微小RNA-195-5p

2.3 甲状腺癌组织中lncRNA PVT1、miR-195-5p表达相关性

甲状腺癌组织中，miR-195-5p表达和lncRNA PVT1表达呈负相关（r=-0.731，P <0.001）。见图2。

图2 甲状腺癌组织中lncRNA PVT1、miR-195-5p表达相关性

3 讨论

甲状腺癌最常见病理类型为乳头状癌，基因易感性和环境因素的相互作用是导致甲状腺癌发生的关键[7-9]。表观遗传是近年来热点研究领域，lncRNA 调控、组蛋白修饰、DNA 拷贝数改变、DNA 甲基化及乙酰化等参与调控肿瘤细胞的增殖和分化，改变肿瘤微环境，影响肿瘤的演化过程[10-12]。LncRNA PVT1 位于原癌基因c-myc 基因下游，通过结合CDK4 诱导c-myc表达，促进肿瘤发生和进展[13]。基础实验显示[14]，lncRNA PVT1 高表达使胃癌患者对顺铂产生一定的耐药性，影响化疗效果。其他研究发现[2]lncRNA PVT1 能够激活Zeste 同源物增强子2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2），使p16表达上调，促进癌细胞增殖及分化。本研究结果显示，甲状腺癌组织中lncRNA PVT1 相对表达量上升。其机制可能为癌组织中原癌基因c-myc表达上调，从而激活其下游靶基因lncRNA PVT1，使其相对表达量增加[13]。本研究发现甲状腺癌组织中lncRNA PVT1表达与淋巴结转移和TNM 分期有关，提示lncRNA PVT1 在甲状腺癌的演化过程中发挥重要作用。可能的机制为lncRNA PVT1 上调诱导EZH2基因表达，而活化的EZH2 基因通过结合转录因子E2F，使细胞周期中的G1期缩短，从而使癌细胞迅速增殖，同时，活化的EZH2 基因也能使干细胞的分化功能受阻，从而抑制正常组织的修复作用，间接导致癌细胞的侵袭力增强[2]。此外，lncRNA PVT1表达上调后可以增强上皮-间质转化相关因子ZEB1和ZEB2的活性，使癌细胞的黏附能力下降、极性丧失，从而使其迁移能力增加，加速肿瘤进展[15]。

MiR-195-5p 属于miR-15 家族，位于17号染色体，在宫颈癌和肝癌等多种癌症中具有抑癌基因作用[5,16]。研究发现[5]，miR-195-5p 能够抑制多梳蛋白样基因3表达，使多梳蛋白转录受阻，从而导致胚胎干细胞自我更新能力增强以及减弱对同源功能基因沉默的作用，对抑制肿瘤细胞的形成和生长具有作用。本研究结果显示，甲状腺癌组织中miR-195-5p 相对表达量下降。其机制可能为癌组织中的DNA 甲基转移酶使miR-195-5p的启动子区域形成CpG 岛，诱导miR-195-5p 自身发生甲基化，使其基因沉默，从而使miR-195-5p表达下调[17]。本研究结果显示，甲状腺癌组织中miR-195-5p表达与淋巴结转移和TNM 分期有关。其原因可能为下调的miR-195-5p 对成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）的抑制能力减弱，而FGF2 是细胞增殖和血管生成的重要因子，其功能的增强可以促进癌细胞无限增殖并诱导癌周组织形成新生血管，从而促进癌细胞的侵袭和转移[18-19]。此外，miR-195-5p 相对表达量降低使细胞周期蛋白依赖性激酶8（cyclin-dependent kinases 8，CDK8）的活性增强，而CDK8 通过RNA 聚合酶Ⅱ转录调节物12 使大量细胞进入G1/S 期，导致癌细胞分裂的细胞周期缩短，增强癌细胞的增殖和分化能力[20-21]。

本研究结果显示，甲状腺癌组织中miR-195-5p和lncRNA PVT1表达量呈负相关，提示lncRNA PVT1可能与miR-195-5p 相互作用，进而调控甲状腺癌的进展。研究显示[22]，lncRNA PVT1 能够激活miR-195-5p启动子区域的组蛋白H3K27me3，从而使miR-195-5p基因沉默。既往报道指出[23-24]，lncRNA PVT1可以作为miRNA的分子海绵，以吸附结合的方式影响miRNA表达。同时，lncRNA PVT1 结合miR-195-5p 后，抑制端粒酶逆转录酶能力减弱，加速甲状腺癌进展[25]。由于研究设备的限制，miR-195-5p和lncRNA PVT1的具体机制仍有待深入研究。

综上，甲状腺癌组织中lncRNA PVT1表达上调，而miR-195-5p表达下调，二者均与淋巴结转移和TNM 分期有关，对评估患者病情及确定治疗靶点具有潜在应用价值。