“防风-白术”抗结直肠癌作用机制的网络药理学研究

张 芳 沈 趣 吴 繁 王彬彬

结直肠癌发病率居所有癌症的第三位，死亡率近年已跃居癌症第二位[1-2]。结直肠癌病因尚不明确，但大量的研究证据表明结直肠癌的发生发展是有遗传、环境和生活因素等多方面作用的结果，与结肠癌家族史、炎症性肠病、红肉和加工肉摄入、糖尿病、肥胖、吸烟、饮酒等危险因素相关[3]。结直肠癌属中医“癥瘕”“庙瘤”“积聚”“肠覃”“大瘕泄”“锁肛痔”“肠风”“脏毒”等范畴[4-5]。中医认为，结直肠癌发病多由先天禀赋不足、肝气郁结、饮食失调、外感湿邪、脾肾亏虚等导致脏腑功能失调，湿热内生，蕴结肠道，积久而发病。临床治疗结直肠癌多从肠道湿热论治，用药以防风、白术使用最为频繁，患者反馈获益颇佳。白术健脾补中气使脾气自健，以补其虚；防风行气活血化瘀使湿行瘀散，以治其实。目前防风-白术治疗结直肠癌的分子机制和药效物质基础尚不明确，以致其在临床上未被广泛应用。

1 资料与方法

1.1 防风-白术主要化学成分筛选 本研究通过中药系统药理学数据库（TCSMP，https//lsp.nwu.edu.cn/tcsmp.php）[6]检索，以口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18 为阈值，筛选出防风-白术的主要化学成分。

1.2 防风-白术主要化学成分基因靶点预测 利用uniport（https://www.uniport.org/）数据库将已筛选出的防风-白术主要化学成分对应的靶点与相应的人类已知基因靶点匹配[7]。

1.3 CRC 基因靶点预测 在GeneCards（https://www.genecard.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）数据库检索结直肠癌相关基因，获得结直肠癌相关基因。

1.4 网络合并及分析 使用R 语言选取药物主要成分基因靶点与疾病基因靶点交集，并绘制venn图，并将防风-白术的活性成分与预测的基因交集关联，很有可能得到防风-白术治疗结直肠癌的活性成分及基因靶点，采用Cytoscape 3.7.1 软件对所得结果进行可视化处理，并采用拓扑学分析各网络节点的介度、紧密度以及连接度，遴选防风-白术治疗结直肠癌的核心蛋白。利用String 数据库（https://string-db.org/Version 11.0）预测靶标蛋白相互作用关系，把防风-白术预测作用靶标导入String 数据库，获得靶标蛋白相互作用关系。

1.5 防风-白术抗结直肠癌靶点生物功能分析及通路分析 应用R 语言对防风-白术治疗结直肠癌的靶点进行GO（Gene Ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信号通路富集分析，探究防风-白术治疗结直肠癌潜在靶点涉及的生物学过程及信号通路。

2 结果

2.1 防风-白术化学成分筛选及靶点预测 通过TCSMP 数据库检索，以口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18 为筛选条件并筛去无对应靶点的成分，得到防风-白术活性化合物紫花前胡素、珊瑚菜素、防风色酮醇、α-香树精等共25 种。利用Uniport 数据库将靶点名称统一标准化处理后发现20 个活性成分具有对应靶点（见表1），共对应61 个靶点。

表1 防风-白术活性成分

2.2 防风-白术治疗结直肠癌的候选靶点 通过GeneCards 数据库检索得到与结直肠癌相关靶点共9330 个，由于靶点数量大，选取其中relevance＞10 的靶点作为研究对象，得到密切关联靶点1262 个。通过OMIM 数据库检索得到与结直肠癌相关基因341个，两个数据库共筛选得到基因靶点1603 个。通过R 语言对比分析结直肠癌与防风-白术有效活性成分对应靶标的共有部分，最终得到防风-白术活性成分治疗结直肠癌的潜在靶点共35 个，并绘制成Venn图。见表2，图1。

图1 结直肠癌与防风-白术相关靶点韦恩图

表2 防风-白术抗结直肠癌预测靶标

2.3 防风-白术活性成分抗结直肠癌的作用靶标分析 将筛选的活性化合物及靶点导入Cytoscape

3.7.1 软件构建“疾病-药物-成分-靶标”网络图（见图2），其中，三角形节点代表防风-白术有效活性成分，圆形节点代表作用靶标，菱形节点代表结直肠癌，六边形节点代表防风-白术，边线代表药物、疾病、活性成分与靶标之间的相互联系。汉黄芩素（Wogonin）对应的靶点最多，共有29 个靶点与其直接相连，前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）与有效化合物及结直肠癌间联系边线最多，提示汉黄芩素可作为防风-白术抗结直肠癌的关键药理成分，通过影响PTGS2 发挥抗结直肠癌作用。从图2 中可以看出，防风的多个活性成分可作用于一个靶点，也可以作用于不同靶点，同时，35 个作用靶点涉及多条信号通路，且多条信号通路中又可通过共有靶点相连，体现了防风-白术多成分、多靶点、多通路协同抗结直肠癌的作用机制。

图2 “疾病-药物-成分-靶标”网络图

2.4 防风-白术与结直肠癌相关靶标PPI 网络的构建与分析 在String 数据库平台构建共有靶点的蛋白互作PPI 网络（见图3），将数据导入Cytoscape 3.7.1 软件，利用软件分析和处理（见图4），网络中节点大小及颜色深浅反应Degree 值的大小。PPI 网络前十的核心基因分别是CASP3、AKT1、JUN、CCND1、IL-6、ESR1、PTGS2、RELA、MAPK14、CDKN1A。

图3 String 平台PPI 网络互作图

图4 靶标互作网络图

2.5 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 采用Conbioconductor 数据库及R 语言对防风-白术、CRC 的交集靶点进行GO 功能富集分析，设定标准为P 值＜0.05，GO 分析得到具有显著意义的65 条GO 功能条目，均为分子功能，前20 条GO 分析结果如图5 所示，主要涉及结合DNA 结合转录因子（DNA-binding transcription factor binding）、核受体活性（nuclear receptor activity）、配体激活的转录因子活性（ligand-activated transcription factor activity）等过程。KEGG 分析共得到139 条具有显著意义的通路，前20 条与结直肠癌相关度较高的通路如图6所示，圆点越大颜色越红，表明该通路富集的靶点越多，P 值也越小，排名靠前的信号通路主要有人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（Hepatitis B）、Kaposi 肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）等。

图5 核心靶点的GO 分析

图6 核心靶点的KEGG 分析

3 讨论

本研究基于网络药理学探讨防风-白术治疗结直肠癌的潜在作用机制，构建疾病-药物-成分-标靶网络，该网络表明了防风-白术治疗结直肠癌具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，该网络提示抗结直肠癌的核心成分为汉黄芩素、β 谷甾醇、3β-羟基苍术酮。汉黄芩素能够通过下调绿胆素还原酶A（BLVARA），达到抑制结直肠癌细胞系HT-29 及SW620 细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤上皮-间质转化（EMT）进程，从而发挥抗结直肠癌作用[8]。Β-谷甾醇可以抑制肿瘤细胞增殖、诱导期凋亡，抑制其迁移和侵袭，通过Akt/GSK-3β 信号通路抑制EMT[9-10]，并且能够调节巨噬细胞的功能，降低IgG、IgG1 等特异性抗体水平，抑制炎症细胞因子产生[11]，从而减轻肿瘤病人的炎症反应。

将药物-疾病交集靶点进行蛋白互作网络的分析，利用Cytoscape 的cytohubba 插件MCC 算法计算出PPI 网络前十位核心基因，与CRC 相关度较高的靶点有CASP3、AKT1、JUN、CCND1、IL-6、ESR1、PTGS2 等。故推测上述靶点与防风-白术治疗结直肠癌的作用机制密切相关。CASP3 通过切割各种基本细胞蛋白在凋亡通路中起着关键作用，在结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌等几种类型癌症中，CASP3mRNA 水平明显低于正常人[12]，通过调节CASP3 水平治疗结直肠癌[13]。AKT1 是PI3K/Akt 信号通路中的核心靶标，调控细胞代谢、细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡和血管生成等方面[14]。异常激活的Akt 可通过抑制蛋白水解酶Caspase9 活性促使结直肠癌细胞逃避细胞凋亡，同时激活下游mTOR 标靶引发一系列反应进而导致结直肠癌细胞增殖、血管生成和侵袭等[15]。JUN在细胞增殖、凋亡、应激反应及肿瘤的发生发展中发挥中要作用[16]。CCND1 基因编码的细胞周期蛋白，具有促进细胞增殖和基因转录等功能，可在多种癌症中成高表达，阻断CCND1 编码细胞周期蛋白的治疗策略将有助于干扰多种癌症特异性新高通路达到治疗癌症的目的[17]。IL-6 持续可激活各种炎症/免疫/凋亡基因，如Bcl-2 基因家族和VEGF，这些基因导致肿瘤细胞入侵、血管生成和转移[18]。ESR1 在结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常的结直肠组织[19]，给予结直肠癌患者5-FU 治疗后可显著降低患者癌组织中ESR1 mRNA 的表达水平及无病生存期（DFS）[20]。PTGS2 参与大肠癌发展的早期阶段，最初影响肿瘤的基质微环境，然后影响上皮细胞，并且PTGS2 表达与结直肠癌中端粒酶活性之间成负相关关系[21]。

GO 功能富集分析共得到65 个富集项，且均为分子功能，防风-白术治疗结直肠癌可能与核受体活性、配体激活的转录因子活性、结合DNA 结合转录因子、蛋白质丝氨酸/苏氨酸活性、类固醇结合等条目密切相关。促进胆汁酸核受体活性可以明显抑制直肠肿瘤细胞增殖能力[22-23]。抗炎、抗菌、抗脂质过氧化、KEGG 通路富集提示，防风-白术抗结直肠癌的信号通路主要集中在恶性肿瘤、CRC 相关通路等，与AGE-RAGE 信号通路、乙型肝炎、人巨细胞病毒感染、IL-17、EB 病毒感染等信号通路密切相关。AGERAGE 信号通路激活可促进直肠癌HCT116 细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力，并维持肿瘤细胞干性，其机制可能与AGE/RAGE/通路介导的EMT 有关[24]。结直肠癌患者血清HBs Ag 表达可能与结直肠癌的肝转移及浸润深度有关[25]，慢性HBV 感染与结直肠癌风险增加显著相关[26]。人巨细胞病毒编码的US28 基因使结直肠癌患者有更大的化疗耐药性及更高的侵袭能力，并加速细胞周期进展[27]。IL-17 在结直肠癌患者的血清和组织中表达上调，在结直肠癌的转移和预后中有重要作用，可以抑制结直肠癌的发生[28]。EB 病毒诱导基因3 可能介导结直肠癌细胞对5-FU 的耐药过程[29]。

综上所述，本研究应用网络药理学方法预测了防风-白术治疗结直肠癌的作用靶点及作用机制，阐明防风-白术通过多成分-多靶点-多通路治疗结直肠癌，为进一步实验研究和临床应用提供了新思路、指明了新方向。但是，基于网络药理学研究药物治疗疾病的靶点仍存在局限性，其虽然能较为系统地预测活性成分、作用靶点与作用通路，但预测结果不能完全证明其正确性，其作用机制需要开展体外和体内实验进行验证。