基于生物信息学构建宫颈鳞癌预后相关的免疫基因风险模型①

李 纯 张 青 魏 巍 （大连大学附属中山医院，大连116001）

宫颈鳞状细胞癌（cervical squamous cell carcino‑ma，CSCC）严重威胁女性健康，每年可导致几十万例患者死亡［1］。早期宫颈癌患者建议采取手术治疗，但晚期患者现有治疗手段疗效较差［2］。目前，国际妇产科联合会FIGO 分期是CSCC 最重要的预后因素，但无法反映CSCC 的生物学异质性。因此，识别与CSCC 预后相关的生物标志物，实现精准个体化治疗对患者尤其是晚期患者极为重要。免疫治疗是癌症个性化诊疗的主要驱动力，是新的宫颈癌治疗模式［3］。但免疫相关基因（immune related genes，IRGs）在宫颈癌临床相关性和预后中的意义尚未阐明。因此，本研究拟基于宫颈癌的IRGs构建风险模型，对宫颈癌患者进行分组，系统分析IRGs与预后的相关性，深入了解IRGs对宫颈癌预后的潜在临床应用价值，为宫颈癌靶向治疗提供新的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 材料 从TCGA 和GTEx 数据库下载268 例CSCC临床样本的mRNA数据和临床信息，其中包含255例肿瘤标本和13例非肿瘤标本。通过免疫学数据 库 和 分 析 门 户 TCIA 数 据 库（https：/ /tcia. at/home）下载IRGs。

1.2 方法

1.2.1 差异基因分析 采用limma 包以FDR<0.05和|log2（FC）|>1 为阈值对所有转录数据进行差异分析，筛选所有差异IRGs。采用DAVID 数据库行GO和KEGG功能富集分析。

1.2.2 生存分析及TFs 的调控 通过单因素COX回归分析与生存相关的IRGs。从STRING 在线数据库提取临床相关转录因子（TFs），通过Cytoscape 软件构建IRGs 和TFs 调控网络，探讨TFs 和转录组的调控联系。

1.2.3 建立免疫相关基因的预后模型 基于多因素COX 回归分析整合的IRGs 作为独立的预后指标，以IRGs 表达数×Cox 回归系数构建预后模型。将患者按中位PI 值分为高、低风险组，评估不同宫颈癌患者PI 的预后价值。分别采用单因素和多因素COX 回归评估临床变量及风险评分与患者预后的相关性，判断风险模型可否作为独立的预后指标。采用Kaplan-Meier 曲线法分析高、低风险组OS，采用受试者工作特征（ROC）曲线评估模型的预测性能。

1.3 统计学处理 通过R 软件包计算生存ROC AUC，采用独立t检验检验临床参数差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达IRGs 及功能富集分析 limma 包共识别出293 个差异表达IRGs，其中105 个下调基因和188 个上调基因（图1A）。对 293 个IRGs 进行GO和KEGG 分析，GO 词条中，生物学过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）富集最为丰富的分别是regulation of leukocyte activation、side of membrane、cytokine receptor binding。KEGG 功能富集分析主要富集于NF-κB、细胞黏附分子、细胞-细胞受体相互结合等信号通路（图1B）。

图1 差异表达的IRGsFig.1 Differentially expressed IRGs

2.2 预后相关差异表达IRGs 鉴定 单因素COX回归分析显示，有33 个差异表达IRGs 与患者OS 相关（图2A），包括24 个低风险基因及9 个高风险基因。将上述33个基因进行多因素Cox分析，筛选出7 个 IRGs 与 OS 相 关 ，其 中 FOXP3、ANKRD22 和FRAT2 与 OS 呈正相关，而 CCL20、NRP1、CXCL1 和SPP1与OS呈负相关（图2B）。

图2 预后相关IRGsFig.2 Prognosis related IRGs

2.3 建立免疫相关基因的预后模型及生存分析 基于以上7个IRGs表达谱构建预后风险评分模型，风险值（PI）＝（CCL20×0.128 7）+［FOXP3×（− 0.765 7）］+（NRP1×0.435 3）+［ANKRD22×（−0.287 4）］+［FRAT2×（−0.369 3）］+（CXCL1×0.149 1）+（SPP1×0.228 7），计算各患者PI 值，以 PI 中位数为截断值，将患者分为高、低风险组。与高风险组相比，低风险组平均OS 较长，死亡数明显减少。热图显示，7个IRGs在高、低风险组中的表达值存在明显差异（图3A）。此外，Kaplan-Meier生存分析提示，高风险组患者OS显著缩短（P=6.116e-11，图3B）。

图3 基于IRGs的预后模型Fig.3 Prognostic model based on IRGs

2.4 生存影响因素的Cox 回归分析 对年龄、FI‑GO 分期、分级及风险值与OS 的相关性进行单因素和多因素Cox 回归分析，结果显示，预后模型风险值是OS 的独立预后因素且为高风险因素（P<0.001，图4）。

图4 宫颈癌OS预后因素的回归分析Fig.4 Regression analysis of cervical cancer prognostic factors for OS

2.5 IRGs 临床相关性分析 对7 个IRGs、风险值与临床变量，如年龄、FIGO分期、分级进行相关性分析，结果显示，ANKRD22、CCL20 在grade3-4 中低表达；SPP1 与 riskScore 在stage3~4 中高表达（P<0.05，图5）。表明以上IRGs在预后预测方面具有一定价值。

图5 IRGs表达与临床变量相关性分析Fig.5 Relationships between IRGs expression and clinico⁃pathological factors

2.6 TFs 网络图 为探讨预后相关差异表达IRGs的潜在分子机制，检测318 个TFs 表达谱，筛选出99 个差异表达 TFs 与 CSCC 相关（图 6A）。对 99 个TFs 与33 个预后相关差异IRGs 进行相关性分析，构建6 个TFs 和24 个预后相关差异IRGs 的网络图（CorFilter>0.3，图6B）。

图6 TFs调控网络Fig.6 TFs regulatory network

3 讨论

CSCC 是女性常见恶性肿瘤，其发病率逐年上升［4］。本研究共筛选出293个差异表达IRGs，KEGG分析发现，以上IRGs 主要富集于NF-κB 通路。NF-κB 信号途径在免疫调节及肿瘤发生发展中起重要作用，被认为是导致宫颈癌HPV 持续感染的重要因素［5］。COX 回归构建 7 个 IRGs 预后模型，将患者分为高、低风险组，两组患者OS差异显著，且模型风险值是OS 的独立预后因素，表明IRGs 预后模型对CSCC预后评估及个体化治疗有重要意义。

预后模型中，FOXP3、ANKRD22 和 FRAT2 表达与OS呈正相关，属低风险IRGs。熊洁［6］发现FOXP3在高-中分化组中阳性表达率显著低于低分化组，且与患者年龄分期无关。本研究发现，ANKRD22 与分级呈负相关，在前列腺癌中ANKRD22 表达与分期呈负相关，具有保护作用［7］。FRAT2 是 WNT 信号通路的正调控因子，通过激活WNT信号通路参与肿瘤发生［8］。

此外，本研究中 CCL20、NRP1、CXCL1 和 SPP1与患者OS 呈负相关，属高风险IRGs。宫颈癌组织中CCL20表达明显增高，并与宫颈癌复发相关［9］；体外实验证实，CCL20/CCR6 可促进宫颈癌细胞迁移［10］。此外，研究发现，抑制 NRP-1 基因表达可降低宫颈癌细胞活力，诱导细胞凋亡，其表达与癌细胞活性呈正相关［11］。血清CXCL1 表达在宫颈癌患者中明显升高，与宫颈癌血管生成相关，并可诱导癌细胞增殖和克隆形成［12-13］。研究报道，SPP1 与宫颈癌发生有关，在 CSCC 中显著上调［14］。CHEN 等［15］采用基因芯片技术发现，SPP1在宫颈癌组织和细胞系中呈高表达，抑制SPP1 表达可抑制HeLa 细胞增殖，诱导凋亡，增加顺铂敏感性。本研究中，CCL20、NRP1 CXCL1 和 SPP1 在 CSCC 组织中呈高表达，是宫颈癌的危险因素，与既往研究结论相符。

本研究构建了1 个TFs 与IRGs 网络图，其中STAT1、TP63、、BATP 等 TFs 在该网络中占据重要位置。STAT1在CSCC中有重要意义，STAT1在恶性肿瘤组织中表达显著增加［16］。此外，TP63基因甲基化率在宫颈癌组织中显著升高［17］。文献显示，BCL11A在宫颈癌组织中高表达且与淋巴结转移密切相关［18］。Sox2 在宫颈鳞癌中高表达，并可促进宫颈癌进展［19］。但BATP和IRF5在宫颈癌中的作用有待进一步研究。

本研究通过生物信息学分析筛选出7个与预后显著相关的IRGs，基于以上7个IRGs 构建的风险模型将患者分为高、低风险组，且独立于其他临床变量预测患者预后，为CSCC 预后预测及免疫相关个性化治疗方案制定提供依据。